Abstrakt
Kvantitativní stanovení
glykovaného hemoglobinu A1c na automatickém kapalinovém chromatografu Arkray
Adams HA-8180, určeného
ke stanovení stabilní A1c frakce GHb na principu iontově výměnné
chromatografie.
Seznam souvisejících dokumentů
Laboratorní příručka
Příručka kvality
Provozní řád
Skartační řád
S-OKBH-004
Směrnice pro IKK - OKBH
PI-OKBH-90 Manuál analyzátoru Arkray Adams HA-8180
Příbalový leták kontrolního materiálu společnosti Arkray,
MAS Diabetes QC Kit. REF:
DBCL-MP
Návodu k obsluze
přístroje Arkray Adams HA-8180 (externí dokumentace)
Kódy, názvy, definice a terminologie
Glykovaný hemoglobin A1c,
HbA1c , glykohemoglobin A1c, HbA1c
Název v lokálním číselníku LIS: Glykovaný
hemoglobin A1c
Klíč v lokálním číselníku LIS: BGHBA1C
Číslo metody v lokálním
číselníku LIS: 40
Seznam zdravotních výkonů VZP: 81449
Princip
Metoda využívá principy iontoměničové vysokoúčinné
kapalinové chromatografie (HPLC). Vzorky jsou automaticky ředěny ve vzorkovací
stanici a nastřikovány do analytické kolony. Duální čerpadla chromatografu
dodávají naprogramovaný gradient pufru se stoupající iontovou silou do kolony,
kde jsou pak hemoglobiny separovány na základě své iontové interakce s
materiálem kolony. Separované hemoglobiny poté procházejí průtokovou komůrkou
filtračního fotometru, ve kterém se měří změny absorbance při 420 nm.
Další filtr při 500 nm provádí korekci na absorbanci pozadí.
Software přístroje provádí redukci hrubých dat shromážděných
z každé analýzy. Pro úpravu vypočtených hodnot HbA1c
se používá kalibrace ve dvou hladinách. Pro každý vzorek se generuje
záznam vzorku, který zahrnuje retenční časy detekovaných píků a chromatogram.
Pllocha píku A1c se vypočítává pomocí exponenciálně modifikovaného Gaussova
algoritmu (EMG), který odečítá obsah píků labilního A1c a karbamylovanéno hemoglobinu z plochy píku A1c.
Místo provádění postupu
OKBH, úsek
biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703
84 Ostrava-Vítkovice
Bezpečnostní aspekty
Je nutné dodržovat obecné zásady
bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02,
ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu
některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny,
používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci
nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především
rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při
zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při
zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži
omýt velkým množstvím pokud možno vlažné vody popř. mýdlem nebo jiným vhodným
mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2
litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.
Fáze před vyšetřením
Diabetes mellitus je stav,
pro který je charakteristická hyperglykémie v důsledku neschopnosti těla
využívat
krevní glukózu jako zdroj energie. U diabetu 1. typu
nevytváří pankreas inzulín, takže glukóza nemůže vstoupit do buněk, aby byla
využita jako zdroj energie. U diabetu 2. typu buď pankreas nevytváří dostatečné
množství inzulínu nebo tělo nevyužívá
inzulín správně. Přímé a nepřímé účinky hyperglykémie na
lidský cévní systém jsou častou příčinou morbidity a mortality u diabetu obou
typů. Jedná se o komplikace makrovaskulární (ischemická choroba srdeční,
onemocnění periferních tepen a mozková cévní příhoda) a mikrovaskulární
(diabetická nefropatie, neuropatie a retinopatie).
Diabetes mellitus postihuje přibližně 7 % světové populace. Léčba
diabetu vyžaduje dlouhodobé udržování hladiny krevní glukózy co nejblíže
normálním hodnotám, aby se předešlo dlouhodobým následkům na cévním systému. Jediné měření glykémie nalačno ukazuje
okamžitou hladinu glukózy (posledních hodin), ale nemůže ukázat skutečnou
schopnost organismu krevní glukózu regulovat. Měření hemoglobinu A1c (HbA1c)
jednou za dva až tři měsíce je již zavedeným způsobem kontroly glykémie v rámci
léčby a péče o pacienty s diabetes mellitus.
HbA1c se tvoří ve dvou
krocích neenzymatickou glykací HbA. V prvním kroku dochází k tvorbě
nestabilního aldiminu (labilní A1c nebo
pre-A1c), tj. k reverzibilní reakci mezi
karbonylovou skupinou glukózy a valinem na N-konci řetězce β
hemoglobinu. Tvorba labilního A1c je přímo
úměrná koncentraci glukózy v krvi. Během cirkulace červených krvinek se určité
množství labilního A1c přeměňuje
(Amadoriho přesmykem) na stabilní ketoamin HbA1c
Metoda stanovení pomocí soupravy firmy Arkray je založena na
chromatografické
separaci HbA1c na
katexové koloně. Separace je optimalizována tak, aby byly eliminovány
interference
způsobené variantami hemoglobinu, labilním A1c a karbamylovaným hemoglobinem.
Odběr primárního vzorku a transport
Odběr
Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky
s přídavkem EDTA za použití uzavřeného odběrového systému. Pacient
musí být na lačno.
Transport
Transport materiálu na oddělení
OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006
Směrnice pro transport a příjem vzorků.
Skladování
Krev je na OKBH po provedení
analýzy skladována v místnosti k tomu určené po dobu 1 dne pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření a
ověření identifikace.
Interference (podle
příbalového letáku)
Koncentrace hemoglobinu F až do
25 % nezkreslují výsledky analýzy. V případech, kde jsou koncentrace
hemoglobinu F vyšší než 25 %, výsledné hodnoty HbA1c
se nevydávají.
Ikterus, indikovaný koncentracemi
bilirubinu až do 20 mg/dl, nezkresluje výsledky analýzy.
Lipémie, jak potvrdilo měření normálního
a diabetického vzorku s přidaným lipemickým vzorkem klinicky získaného séra s
výslednými koncentracemi triglyceridů až 6 000 mg/dl, nezkresluje výsledky
analýzy.
Labilní A1c, jak signalizují koncentrace glukózy do výše 1000 mg/dl,
nezkresluje výsledky analýzy.
Stabilita měřené veličiny
20 až 25°C: 2 dny, 4 až
8°C: 5 dní, nezamrazovat
Omezení
Laboratoř může odmítnout
přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů
uvedených v Laboratorní příručce v kapitole LP D-02 Kriteria přijetí nebo odmítnutí
vzorku..
Manipulace se vzorky
Manipulace se vzorky probíhá
podle běžných zásad práce s biologickým
infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.
Přístroje a pomůcky
Analyzátor Arkray Adams HA-8180
Reagencie
Spotřební materiálOSN-E
Příprava k činnosti
Před uvedením přístroje do pracovní činnosti se zkontroluje:
Během analýzy se
průběžně kontrolují chromatogramy.
Možné příčiny
abnormálních výsledků:
Chybová hlášení, další
možné problémy a jejich odstranění jsou uvedeny v originálním návodu
k obsluze přístroje Arkray Adams HA-8180
Pracovní postup
Postupuje se podle pracovní instrukce PI-OKBH-90 Manuál analyzátoru Arkray Adams HA-8180
Stručný
popis postupu
Kalibrace a návaznost
Ke kalibraci je používán
kalibrační set Calibrator Kit 80,
REF: 71266
Dvě hladiny
lyofilizovaného standardu na bázi lidského séra, s deklarovanými
hodnotami.
Příprava:
Ø Kalibrátor a speciální rozpouštědlo vyndat
z lednice a nechat stát při pokojové teplotě cca 10 min
Ø Napipetovat přesně 3 ml
rozpouštědla do každé lahvičky s kalibrátorem a uzavřít víčkem
Ø Nechat lahvičky
přibližně deset minut při pokojové teplotě, poté zlehka promíchat bez vzniku
bublinek, dokud není kalibrátor kompletně rozpuštěný
Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do data exspirace
uvedeného na obalu. Po
rozpuštění uchovávat produkt při teplotě 2 °C až 8 °C a spotřebovat během osmi
hodin.
Vlastní kalibrace: Pozn.: Kalibrace
se provádí při výměně kolony, při výsledku kontroly mimo povolené rozmezí.
Postup:
Kalibrační materiál: Calibrator
Kit 80, REF: 71266 (určen pro jedno použití)
Ø Kalibrační
materiál Low solution a High solution pečlivě promícháme a napipetujeme do kepů
Ø Do
stojánku Hemolysis Calibrator Rack vložit na níže uvedené pozice
4. zkumavka nebo kep s plnou
krví
5. zkumavka nebo kep s plnou
krví
9. kalibrační materiál Low
solution
10. kalibrační materiál High solution
Ø Měření zahájit
stisknutím položky START,
přístroj si najede se stojánkem do aspirační pozice
Ø Po ukončení kalibrace
se zobrazí Standby obrazovka
Návaznost: IFCC referenční
metoda.
Charakteristika spolehlivosti
Podle příbalového letáku:
Měřící rozsah: 9 až 195 mmol/mol
Aktuální charakteristiky
spolehlivosti:
Aktuální charakteristiky
spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu.
Dokumentace, zpracování dat a vydávání výsledků
Výsledky stanovení jsou
kontinuálně tištěny a automaticky se kopírují na flash disk, umístěný v
modulu RSLogger za zadní stranou přístroje. Data z flash paměti zálohuje
VŠ do PC dle instrukcí v externím návodu firmy MEDISTA Návod
na správu dat z primární zálohy
výsledku na Arkray Adams A1c HA – 8180V
Všechny výsledky se
rovněž archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému.
Hodnoty výsledků se udávají v celých číslech v jednotkách [mmol/mol].
Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice
Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici
elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u
příjmového okna v laboratoři.
Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány
průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě
se svozem biologického materiálu.
Výsledková zpráva obsahuje:
·
identifikaci
laboratoře, která výsledek vydala
·
odkaz na akreditaci laboratoře
·
datum
a čas vydání nálezu
·
jednoznačnou
identifikaci pacienta
·
zdravotní pojišťovnu pacienta
·
identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)
·
identifikaci požadujícího lékaře (resp.
oddělení)
·
diagnózu pacienta
·
druh biologického materiálu (sérum, plazma, moč,
krev u vyšetření krevního obrazu)
·
jasně
srozumitelnou identifikaci vyšetření
·
datum a čas přijetí vzorku laboratoří
·
datum a čas odběru vzorku
·
výsledek vyšetření s odpovídajícími
jednotkami (SI jednotky)
·
označení akreditované metody
·
referenční intervaly vyšetření
·
interpretaci
výsledků, je-li to nutné
·
jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost
primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek
požadovaného vyšetření)
·
identifikaci osob, které výsledkovou zprávu
kontrolovaly a schválily
·
zkratky identifikující žádanku
·
př. 20.BR-0777
·
20: den v měsíci, BR: biochemie rutina,
0777: číslo vzorku
·
př. 20.HH-0777
·
20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777:
číslo vzorku
Referenční a varovná rozmezí
Referenční meze: 28 až 40 mmol/mol resp. 2,8 až 4,0 %
Interpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášení
Glykace molekuly
hemoglobinu vzniká neenzymovou reakcí glukózy nebo glukoza-6-fosfátu s amino
skupinou termálního valinu beta řetězce hemoglobinu. Z reakční rovnováhy
vyplývá, že podíl glykovaného hemoglobinu je úměrný koncentraci volné glukózy.
Proto u pacientů s trvale zvýšenou hladiny glukózy se vytváří větší množství
glykovaného hemoglobinu. Protože hemoglobin je obsažen v erytrocytech, jsou
děje vázány na dobu života červené krvinky, cca 120 dní, je stanovení
glykovaného hemoglobinu tzv. biochemickou pamětí předcházející hyperglykémií.
Jde tedy o ukazatel stavu glykémie za dobu
4 až 8 týdnů.
Patologické změny
< 42 mmol/mol - kompenzace diabetu: výborná
45 až 60 mmol/mol - uspokojivá
> 60 mmol/mol - neuspokojivá
Řízení kvality
Kvalita je zabezpečována dodržováním pokynů pro
provoz a údržbu přístroje, pravidelnou interní a externí kontrolou kvality.
Ø
Kvalita prováděných
vyšetření je ověřována 1x denně analýzou kontrolního materiálu, který je
specifikován ve formuláři F-OKBH-30. Výsledky kontrol jsou ověřovány obsluhou
ihned po změření, zapsány do formuláře F-OKBH-19 Interní kontrola
kvality a primární data jsou ukládány do
dokumentace u analyzátoru.
Ø
Jako kontrolní materiál se používá EXTENSURE
HbA1c Lyophilised Control, REF: HB711SBAr,
HB712SBAr
Příprava kontroly:
Ø Lyofilizát pro jednotlivé hladiny kontroly
rozpustit v 250µl Aqua Pro Injectione
Ø Kontrolu za občasného promíchání nechat
rozpouštět min. 15 minut
Ø Kontrolu dobře promíchat, rozpipetovat
alikvoty po 5µl do Eppendorf zkumavek a zamrazit na teplotu -20°C
Příprava hemolyzovaného kontrolního
materiálu:
Ø Vyndat
alikvot 5µl z mrazáku, nechat rozpustit při laboratorní teplotě
Ø Přidat 450µl hemolyzačního promývacího
roztoku 80H
Ø Kontrolu promíchat na třepačce vortex
Stabilita: Kontrola je stabilní do data exspirace vyznačené
na obalu.
Kontrola smí být rozmražena
a znovu zamražena jedenkrát
Použití: Měření
kontrolního materiálu se provádí dle
pracovní instrukce PI-OKBH-090 Manuál analyzátoru
Arkray
Adams HA-8180 denně na obou hladinách a po každé kalibraci.
Výsledky
jsou kontrolovány pověřeným
pracovníkem. Postupuje se podle směrnice
S-OKBH-004 Směrnice pro IKK - OKBH.
Dokumentace:
Výsledky interní
kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na
externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time.
Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucí úseku. Zároveň jsou
výsledky interní kontroly kvality zapisovány do formuláře F-OKBH-019 GHb Interní kontrola kvality v dokumentaci u
analyzátoru.
Externí kontrola kvality v rámci
České republiky je organizována společností SEKK, laboratoř se jí účastní 2x
ročně.
Poznámky
Nevyplněno
Jiné související informace
Nevyplněno
Literatura
SLP
Firemní příbalový leták
k soupravě.
Doporučení ČSKB: Změna jednotky pro stanovení glykovaného
hemoglobinu A1c (HbA1c) a rozhodovacích mezí.
Appendixy
Nevyplněno
Autorské poznámky
Nevyplněno
Recenze, schváleníOSN-E
Autor: Mgr. Alena Švihálková