OSN-SAbstraktOSN-E

Kvantitativní stanovení high sensitive troponinu T (hs Troponin T) v lidském séru a plazmě metodou imunoelektrochemiluminiscence soupravou „ECLIA“ na imunochemickém analyzátoru Cobas 6000.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

Skartační řád 

S-OKBH-003 Směrnice pro práci s biol. mater.

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK - OKBH

S-OKBH-005 Směrnice EHK

PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas 6000

Příbalový leták Roche Elecsys Tropo T hs STAT

Příbalový leták Roche Elecsys Tropo T hs STAT CalSet

Příbalový leták Roche Elecsys PreciCon. Tropo T hs
Příbalový leták kontrolního materiálu Biorad Troponins Control

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

Troponin T hs, TnT hs, cTnT hs

Název v lokálním číselníku LIS: hs Troponin T

Klíč v lokálním číselníku LIS: TNT HS

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 1003

Kód metody v analyzátoru Elecsys: 178

Seznam zdravotních výkonů VZP: 81237

OSN-SPrincipOSN-E

Sendvičový princip. Celková doba stanovení 18 minut.

1. inkubace: 15 µl vzorku, biotinylovaná monoklonální protilátka proti troponinu T a monoklonální protilátka proti troponinu T, značená rutheniovým komplexem reagují za tvorby sendvičového komplexu.

2. inkubace: Po přidání mikročástic, potažených streptavidinem, se komplex váže na pevnou fázi prostřednictvím interakce mezi biotinem a streptavidinem.

Reakční směs je nasáta do měřicí komůrky, kde jsou mikročástice zachyceny magnetickým polem na povrchu elektrody. Nenavázané složky jsou odstraněny roztokem ProCell. Přivedené napětí na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je změřena fotonásobičem.

Výsledky jsou vyhodnoceny z kalibrační křivky, která je specifická pro přístroj a je vytvářena na základě dvoubodové kalibrace a základní master kalibrace, dodávané v čárovém kódu reagencie.

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, biochemický úsek, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice S-OKBH-003 Směrnice pro práci s biol. mater. a směrnic VTN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřenímOSN-E

Troponin T (TnT) je složka kontraktilního aparátu příčně pruhovaného svalstva. Ačkoliv funkce TnT je stejná ve všech příčně pruhovaných svalech, stanovované TnT pochází výlučně z myokardu (kardiální TnT,

molekulární hmotnost 39.7 kD) a je zřetelně odlišný od TnT z kosterního svalstva. Vzhledem k vysoké tkáňové specifičnosti je srdeční troponin T (cTnT) kardiospecifický a je vysoce citlivým markerem poškození srdce.

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.

Plazma: Li-heparin, K2-, K3-EDTA, citran sodný.

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při 2-8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedeném v LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

Interference

Stanovení neovlivňuje hemolýza (koncentrace hemoglobinu < 0,1 g/dl), koncentrace bilirubinu (< 462 μmol/l), lipémie (< 1500 mg/dl), koncentrace biotinu (< 50 ng/ml). Interference nebyla zaznamenána od revmatoidních faktorů do koncentrace 2000 IU/ml.

Stabilita měřené veličiny v séru/plazmě

+20 až +25°C: 6 hodin, +4 až +8°C: 4 dny, -20°C: 2 měsíce, zamrazit pouze jednou, nerozmrazovat při vysoké teplotě.

OSN-SOmezeníOSN-E

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole Kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků. Vzorky, které byly stabilizovány azidem sodným, nemohou být použity. Zvláštní pozornost je třeba věnovat pacientům léčeným biotinem, myšími monoklonálními protilátkami a pacientům s vysokým titrem protilátek proti rutheniu. U pacientů, kteří dostávají vysoké dávky biotinu (např. >5 mg/den), mohou být vzorky odebrány nejdříve za 8 hodin po podání poslední dávky biotinu.

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při 4 000 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány.

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Imunochemický analyzátor firmy Roche Cobas 6000

OSN-SReagencieOSN-E

Elecsys Tropo T hs STAT 100 reagent kit, kat.č. 09315349190 - 100 testů

M     Mikročástice potažené streptavidinem (průhledné víčko), 1 nádobka, 12 ml: Streptavidinem potažené částice, 0.72 mg/ml, vazebná kapacita: 470 ng biotinu/mg mikročástic; konzervační látka

R1 Anti-troponin T-Ab~biotin (šedé víčko), 1 nádobka, 18 ml: Biotinylovaná monoklonální protilátka proti troponinu T (myší) 1,5 mg/l; fosfátový pufr 100 mmol/l, pH 6,0; konzervační látka, inhibitory.

R2 Anti-troponin T-Ab~Ru(bpy)2+3 (černé víčko), 1 nádobka, 17 ml: Monoklonální protilátka proti troponinu T (myší) značená rutheniovým komplexem 1,2 mg/l; fosfátový pufr 100 mmol/l, pH 6,0; konzervační látka.

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici ve vzpřímené poloze při teplotě 2-8°C. Před založením do přístroje jsou 1 hodiny temperovány při laboratorní teplotě.

Stabilita: Činidla jsou stabilní do vyznačené doby exspirace při 2-8°C, po otevření při 2–8°C po dobu 12 týdnů, po založení do přístroje po dobu 8 týdnů. 

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

Způsob likvidace: Likviduje se běžným způsobem podle místních předpisů.

Manipulace s reagenciemi: Reagencie v setu jsou sestaveny tak, že jsou připraveny k použití a nesmí být oddělovány. Všechny informace potřebné pro přesnou činnost jsou načteny automaticky z čárového kódu reagencie.

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

11662988 ProCell M, 6x380ml systémový pufr

11662970 CleanCell M, 6x380ml čistící roztok pro měřící komůrku

11706802 Elecsys 2010 Assay Cup, 60x60 reakčních nádobek

11706799 Elecsys 2010 Assay Tip, 30x120 pipetovacích špiček

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu Standby podle pracovní instrukce PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas 6000. Provede se údržba požadovaná softwarem přístroje. Vytemperovaný reagenční set Elecsys Tropo T hs STAT 100 se umístí do reagenčního kruhu a uvolní se uzávěry do pracovní polohy.

OSN-SPracovní postupOSN-E

Před začátkem provozu se provede kontrola stavu reagencií a spotřebního materiálu a v případě potřeby se doplní. V případě založení nového reagenčního setu Troponin T hs se provede před vlastním měřením vzorků kontrola kvality v kontrolním materiálu Elecsys PreciControl Tropo T hs na hladině 1 a 2, (kat.č. 05095107) a Biorad Cardiac Troponins Control. Vyhovuje-li naměřený výsledek (podrobněji Řízení kvality), je možné přistoupit k zakládání vzorků do přístroje. Vzorky jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a vkládány do analyzátoru v šedých stojáncích v primárních zkumavkách s čarovým kódem. Pokud je biologického materiálu málo nebo obsahuje sraženinu, přepipetuje se do Hitachi cupu, který se umístí na primární zkumavku s čárovým kódem. Analyzátor pomocí systému LIS načte podle čárového kódu potřebné požadavky, provede příslušná stanovení a výsledky vypíše na obrazovku analyzátoru Workplace. Pipetuje se 15 μl vzorku. Výsledná koncentrace je vyhodnocena z kalibrační křivky specifické pro přístroj. Vzorky s koncentrací vyšší než rozsah měření, mohou být naředěny dilučním roztokem Diluent Universal. Doporučený poměr ředění je 1:10. Výsledky jsou automaticky odesílány do LIS kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

V průběhu dne obsluha analyzátoru doplňuje spotřební materiál přístroje - špičky a cupy, roztoky ProCell, ClenCell a likviduje odpadní materiál.

Kontrola kvality se provádí denně, dále po každé kalibraci, při výměně setu stejné šarže a v dalších případech indikovaných vedoucím úseku. Kalibrace je prováděna kalibračním materiálem Troponin T CalSet firmy Roche, vždy u nové šarže a dále podle potřeby.

Odpadní materiál (špičky a cupy a tekutý odpad z analyzátoru) je průběžně likvidován podle vnitřních hygienických předpisů. Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas 6000.

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

1. Vloží se reagenční souprava.

2. V případě potřeby se provede kalibrace.

3. Vloží se analyzované vzorky do analyzátoru.

4. Spustí se analýza.

5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Ke kalibraci Elecsys Troponin T hs STAT testu je používán kalibrátor Troponin T hs STAT CalSet (kat. č. 09315381190) (Roche). Každý reagenční set je označen čárovým kódem, který obsahuje specifické informace potřebné pro kalibraci jednotlivých šarží reagencií. Předdefinovaná kalibrační master křivka je adaptována na daný analyzátor použitím Elecsys Troponin T hs STAT CalSet, který obsahuje Troponin T (rekombinantní, lidský) ve dvou koncentračních hladinách (cca 0,1 ng/ml a cca 10 ng/ml) v matrix lidského séra.

Příprava Lyofilizovaný kalibrátor se rozpustí v přesně 1,0 ml destilované vody a uzavřený nechá stát

15 minut kvůli rekonstituci. Opatrně se zamíchá, aby nedošlo ke vzniku pěny. Rekonstituovaný kalibrátor se rozpipetuje do alikvotačních nádobek a uchovává při -20°C.

Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do data exspirace uvedeného na obalu, při teplotě skladování

2‑8°C. Rekonstituovaný kalibrátor je stabilní 2 týdny při 2–8°C a 3 měsíce při -20°C.

Vlastní kalibrace: Kalibrace se provádí vždy při založení nové šarže kazety a dále podle potřeby

v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality. Nádobky s roztoky Cal1 a Cal2 se vloží do stojánku, v analyzátoru se zadá příslušný požadavek a odstartuje kalibrace. Výpočet je zajištěn prostřednictvím softwaru analyzátoru

Návaznost: Stanovení Elecsys Troponin T hs STAT bylo standardizováno dle stanovení Troponin T STAT

(04660307190). To bylo zase původně standardizováno podle metody Enzymun‑Test Troponin T (CARDIAC T).

Způsob dokumentace kalibračních dat: Hodnoty kalibrací se uchovávají v paměti přístroje. Výsledky každé

kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací analyzátoru Cobas 6000.

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristiky spolehlivosti z příbalového letáku:

Měřící rozsah: 3 – 10 000 ng/l

Opakovatelnost (přesnost v sérii): CV 0,7 – 5,6 % dle hladiny

Reprodukovatelnost (mezi sériemi): CV 0,7 – 7,8 % dle hladiny

Mez detekce (analytická citlivost): 5 ng/l

Porovnání metod:

Porovnání stanovení Elecsys Troponin T(y), s Elecsys Troponin T hs stat (x) za použití klinických vzorků, poskytlo uvedené výsledky:

Počet naměřených vzorků: 42

Passing/Bablok    Lineární regrese

y = 0.99x + 0.47 y = 1.02 x - 14

τ = 0.951 r = 0.999

Koncentrace vzorků se pohybovala v rozmezí přibližně 3 až 81 000 ng/l.

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu.

OSN-SDokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému.

Hodnoty výsledků se udávají na dvě desetinná místa v ng/l.

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

Výsledková zpráva obsahuje:

· identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

· odkaz na akreditaci laboratoře

· datum a čas vydání nálezu

· jednoznačnou identifikaci pacienta

· zdravotní pojišťovnu pacienta

· identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

· identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

· diagnózu pacienta

· druh biologického materiálu (sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

· jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

· datum a čas přijetí vzorku laboratoří

· datum a čas odběru vzorku

· výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

· označení akreditované metody

· referenční intervaly vyšetření

· interpretaci výsledků, je-li to nutné

· jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

· identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

· zkratky identifikující žádanku

· př. 20.BR-0777

· 20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

· př. 20.HH-0777

· 20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

OSN-SReferenční a varovná rozmezíOSN-E

Cut - off = 14 ng/l

Postup pro nahlášení kritické hodnoty výsledku laboratorního vyšetření je uveden ve směrnici S-OKBH-012 Směrnice pro vydávání výsledků.

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Srdeční troponin T roste cca. 3-4 hodiny po infarktu myokardu (AMI) a může přetrvávat až 2 týdny po něm. Na rozdíl od IM s elevací ST úseku EKG (STEMI) závisí diagnóza IM bez elevace ST úseku EKG (NSTEMI) zejména od výsledku srdečního troponinu. Podle této redefinice je IM diagnostikován, jestliže jsou hladiny srdečního troponinu v krvi nad 99. percentilem referenčního limitu (zdravé populace) za přítomnosti

příznaků akutní ischemie (symptomy, změny EKG nebo výsledky snímků). Definice vyžaduje stanovení troponinu s nepřesností (variační koeficient) u 99. percentilu menší nebo rovnou 10 %. Srdeční troponin T (cTnT) je nezávislým prognostickým markerem, který predikuje krátko, středně nebo dlouhodobou perspektivu pacientů s akutním koronárním syndromem (ACS). Na základě výsledků 4 multicentrických studií, zahrnujících více než 7000 pacientů, je prokázané, že srdeční troponin T je rovněž přínosný při

výběru pacientů, u kterých bude úspěšná antitrombotická terapie (GPIIb/IIIa inhibitory, nízkomolekulární heparin). Srdeční troponin je rovněž upřednostňovaným markerem poškození srdce v nových směrnicích pro diagnózu a léčbu akutního koronárního syndromu bez elevace ST-úseku. Nízké koncentrace troponinu T lze detekovat u klinicky stabilních pacientů, jako jsou pacienti s ischemickým nebo neischemickým srdečním selháním, 17,18,19,20 pacienti s různými formami kardiomyopatie se selháním ledvin a diabetem. Zvýšené hladiny troponinu T korelují se závažností onemocnění koronární tepny a slabým výsledkem nezávislým na hladinách natriuretického peptidu (BNP nebo NT-proBNP). Nízké koncentrace troponinu T jsou nezávislým znamením kardiovaskulárních potíží včetně výskytu a opětovného výskytu fibrilace síní. Poškození buňky srdečního svalu, které vede ke zvýšeným koncentracím cTnT v krvi se může vyskytnout i v jiných klinických případech jako jsou myokarditida kontuze srdce, plicní embolie a kardiotoxicita vyvolaná léky

Faktory spojené se zvýšenými hodnotami

Publikované klinické studie prokázaly, že zvýšené troponin T lze nalézt u pacientů s poškozením srdce, jakým je nestabilní angina pectoris, srdeční kontuze či u transplantace srdce. Zvýšení bylo zaznamenáno i u pacientů s rhabdomyolýzou a polymyositidou.

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Jako kontrolní materiál se používá Elecsys PreciControl Tropo T hs 1 a 2 (kat.č. 05095107)

firmy ROCHE, lyofilizovaný Troponin T (rekombinantní, lidský) ve dvou rozmezích koncentrace (cca 0,03 µg/l a cca 2,5 µg/l) v matrix z lidského séra. Dále se používá kontrolní materiál Biorad Cardiac Troponins Control, který se po rozmražení připraven k použití.

Příprava: Po opatrném otevření lahvičky, aby se zabránilo jakékoliv ztrátě lyofilizátu, se přidá přesně 2 ml

deionizované vody skleněnou pipetou. Lahvička se pečlivě uzavře a obsah se rozpustí během 15 minut, za občasného opatrného promíchání kroužením lahvičky tak, aby se zabránilo pěnění. Netřepe se. Po dokonalém rozpuštění se kontroly rozpipetují do zkumavek Eppendorf zamrazí se při – 20°C pro pozdější použití. Před vlastním použitím se nechá již zmrazený kontrolní materiál vytemperovat na laboratorní teplotu.

Stabilita: Lyofilizované kontrolní materiál Elecsys PreciControl je stabilní při +4°C do data exspirace

vyznačené na obalu. Po rozpuštění je stabilní nejméně 5 hodin při +25 °C, 2 týdny při +4 - 8 °C, 3 měsíce při -20 °C pokud je kontrolní materiál zmražen po částech okamžitě po rekonstituci. Kontrolní materiál není možné opakovaně zamrazovat. Kontrolní materiál Cardiac Troponins Control je stabilní při skladování při -20 °C do data exspirace. Po rozpuštění je stabilní 1 měsíc při skladování při +4 - 8 °C. Kontrolní materiál je rovněž možné po alikvotaci opět zamrazit, stabilita je 1 měsíc.

Použití: Měření kontrolního materiálu se provádí denně střídavě na jedné z hladin, po každé kalibraci, při

výměně setu stejné šarže. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004 Směrnice pro IKK - OKBH.

Externí kontrola kvality v rámci České republiky je organizována SEKK, laboratoř se jí účastní 2x ročně.

Dokumentace: Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí

disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucí úseku.

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SJiné související informaceOSN-E

nevyplněno

OSN-SLiteraturaOSN-E

SLP

Firemní příbalový leták k soupravě. 

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Hana Valentová