Abstrakt
Zhotovení, panoptické barvení a hodnocení
nátěru periferní krve. Zjišťuje se početní zastoupení jednotlivých typů leukocytů
a posuzuje se morfologie elementů všech krevních řad.
Seznam souvisejících
dokumentů
Laboratorní
příručka
Příručka
kvality
Provozní
řád
Skartační
řád
S-OKBH-004
Směrnice pro IKK-OKBH
S-OKBH-005
Směrnice EHK
LP C-11
Informace k transportu vzorků
SOPT Mikroskop
PI-OKBH-45 Barvení nátěrů periferní krve,
IKK
Kódy, názvy, definice a
terminologie
Reagenční souprava: May-Grünwald roztok, kat.č.21060-110000, Giemsa Romanowski roztok,
kat.č.14460-11000
Název v lokálním
číselníků LIS: diferenciál mikroskopicky
Klíč v lokálním
číselníků LIS: KOK, KOB
Číslo metody
v lokálním číselníku LIS: 750-776
Seznam zdravotních
výkonů VZP: 96713 Krevní nátěr
96711 Panoptické obarvení nátěru
96315 Analýza
nátěru panopticky obarveného
Princip
Mikroskopické
vyšetření panopticky obarveného nátěru (Pappenheimova panoptická barvící
technika) periferní krve umožňující odlišení jednotlivých typů leukocytů a
posouzení morfologie všech krevních
elementů.
Místo
provádění postupu
OKBH, úsek
hematologie, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského
1192/15,70384 Ostrava-Vítkovice
Bezpečnostní
aspekty
Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti
práce podle ČSN 01 8003, směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s
biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí.
Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné
pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít
a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou
vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem.
S-OKBH-003 Směrnice o práci
s biologickým materiálem
Pozor: barvící
reagencie obsahují metanol - toxický při vdechnutí, při styku s kůží a při
požití!!
Fáze
před vyšetřením
Vyšetření slouží ke stanovení
nebo upřesnění diagnózy při zjištění zvýšeného nebo sníženého počtu leukocytů
v krevním obrazu, eventuálně k popisu morfologie leukocytů, erytrocytů
nebo trombocytů.
Odběr
primárního vzorku a transport
Odběr
Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní
krve, do plastové zkumavky s K3EDTA, K2EDTA,
pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno,
nevyžadují se striktní dietní opatření.
Transport
Transport
materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán v laboratorní příručce LP C-11 Informace k transportu vzorků. Transport materiálu
musí být šetrný, rychlý, při teplotě +15 až+
Stabilita
+15 až+
25°C: 5 hodin do zhotovení nátěru
5 hodin nefixovaný a nebarvený nátěr
nabarvený nátěr neomezenou dobu
Skladování
Zkumavka se
vzorkem se po provedení analýzy skladuje při +15 až +
Nátěr PK se
skladuje 1 měsíc.
Omezení
Laboratoř může odmítnout
přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů
uvedených v Laboratorní příručce v kapitole Kritéria pro přijetí nebo
odmítnutí primárních vzorků, a pokud je extrémně překročena mimo laboratorní
doba odezvy.
Manipulace
se vzorky
Před vlastním zhotovením nátěru
je nutné krev vždy dobře promíchat, pro nanesení krve na sklíčko použijeme
aplikátor.
Přístroje
a pomůcky
Mikroskop Olympus BX 43
Hematologický počítač SH-96/24D
nebo LEUKOtest
Barvicí kyvety
Reagencie
1. May-Grünwald solution –
složení: eozin,
metylenová modř pro mikroskopii, metylalkohol, glycerol
2. Giemsa R solution –
složení:
azureozin II, azur II, glycerol, metylalkohol
3. pH=7,0
Buffer Solution
Dodavatel: Diagnostika a.s., Za
Tratí 686, Praha 9
Penta chemicals unlimited s.r.o., Radiová
1122/1, Praha 10
Skladování: při
laboratorní teplotě, barvící roztoky ve tmě
Stabilita: do data
exspirace
Manipulace s reagenciemi
a likvidace: způsobem předepsaným v bezpečnostním listu
Spotřební
materiál
Podložní sklíčko, roztěrové sklíčko,
gáza
Imerzní olej
Benzín
Aplikátory
k nanášení krve
Příprava k činnosti
Barvící roztoky připravit dle
pracovní instrukce PI-OKBH-45 Barvení nátěrů periferní
krveI, IK
Pracovní
postup
1. Zhotovování krevních
nátěrů:
Zhotovení krevního nátěru dle pracovní instrukce PI-OKBH-45 Barvení nátěrů periferní
krveI, IK
2. Barvení
krevních nátěrů:
Barvení krevního
nátěru dle instrukce PI-OKBH-45 Barvení nátěrů periferní
krveI, IK
3. Hodnocení nátěrů:
Hodnocení
nátěru periferní krve se týká
1) Hodnocení kvantitativní
a) Při diferenciálním počtu leukocytů v periferní krvi běžně hodnotíme
za sebou jdoucích 100
leukocytů, u patologických nálezů či při hodnocení externí kontroly
kvality je v rámci zpřesnění doporučováno hodnocení 200 i více leukocytů. Ve
fyziologickém nátěru jsou přítomny tyto elementy bílé řady: neutrofilní
segmenty,neutrofilní tyče, eozinofilní segmenty, bazofilní segmenty, lymfocyty
a monocyty. Patologicky mohou být v nátěru periferní krve přítomna všechna
vývojová stádia
krevních elementů a vzácně při hematogenním rozsevu i nehematopoetické
maligní
buňky a krevní paraziti (např. malarická plazmodia, Leishmania)
b) V nátěru přítomné erytroblasty vyčíslíme početně na 100
leukocytů
Fyziologicky normoblasty nalézáme pouze u novorozenců.
Patologicky u hemolytických anémií, hematologických i nehematologických
malignit
při infiltraci kostní dřeně apod.
Korekci WBC provádí analyzátory
XN-1000 automaticky.
2)
Hodnocení
relativního počtu (schistocyty) – na 1000 erytrocytů (4-5 zorných polí)
dle PI-OKBH-77 Stanovení schistocytů
hodnocení morfologických změn leukocytů, erytrocytů, trombocytů dle
pracovní instrukce PI‑OKBH- 85 Morfologické změny
Mikroskopická analýza:
- Panopticky obarvený nátěr nejprve prohlédnout při
200-400 násobném zvětšení a posoudit jeho kvalitu, buněčnost, rozložení
jaderných buněk a obarvení
- Hodnocení nátěru resp. diferencování provést při
1000 násobném zvětšení. K hodnocení vybereme místo v rozsahu 1-
- Při 1000
násobném zvětšení (tj. imerzní objektiv) kápnout kapku imerzního oleje na nátěr a pod objektivem zjišťovat a
zaznamenávat na sumátoru buněk početní zastoupení jednotlivých typů buněk
bílé řady. Hodnocení se provádí na 100 leukocytů.
- Preparát je
nutno posunovat tzv. meandrovitým pohybem k získání objektivního
výsledku. Větší buňky se vyskytují převážně v okrajích nátěru. Buňky
je možné hodnotit pouze v místech, kde není hustota nátěru příliš
vysoká a buňky se vzájemně nepřekrývají.
- V dobře obarveném nátěru mají neutrofilní
segmenty bledě růžovou cytoplazmu, růžová až červenohnědá zrna a
fialovočervené jádro, které je většinou tvořeno třemi segmenty. Dobrým
ukazatelem správnosti barvení jsou zrna eozinofilů, která se barví cihlově
červeně až oranžovohnědě, jádro je většinou brýlovitého tvaru. Zrna
bazofilů jsou fialovočervená, jádro je laločnaté. Plazma lymfocytů je
modrá, průhledná. Plazma monocytů je šedomodrá, jádro má nepravidelný
tvar.
Leukocyty – hodnotíme:
·
celková charakteristika buňky - velikost buněk (malé,
střední, velké); tvar buněk; N/C (= nukleo-cytoplazmatický poměr)
·
charakteristika jádra – velikost; tvar; uložení
(centricky, excentricky); ohraničení; struktura chromatinu (jemná, hrubá);
jadérka (přítomnost, počet)
·
charakteristika cytoplazmy – zbarvení vč.
homogenity; granulace (přítomnost, počet, zbarvení, velikost, distribuce);
inkluze; vakuolizace; ohraničení cytoplazmy (pravidelné, výběžky,
neohraničené).
Takto můžeme popsat např.:
·
u granulocytů hypersegmentaci (posun doprava) či
hyposegmentaci neutrofilů, Pelgerovu-Huëtovu anomálii či její pseudoformu,
megaloidní (obrovské) segmenty, tyče či metamyelocyty, různé poruchy granulací
(hypo-, hypergranularitu, toxickou granulaci), Dőhleho inkluze, Auerovy tyče;
přítomnost parazitů
·
u lymfocytů LGL (large granular lymphocytes –
mohou fyziologicky tvořit 10 – 15% z celkového počtu lymfocytů
v periferní krvi), reaktivní, atypické/patologické formy lymfocytů (např.
vlasaté“ či „vilózní“ lymfocyty, prolymfocyty, lymfomové buňky apod.)
·
také si všímáme přítomnosti holých jader a
jaderných stínů.
Erytrocyty - hodnotíme
·
velikost erytrocytů – normocyty, mikrocyty,
makrocyty, anizocytóza,
·
barvu cytoplazmy – normochromní, hypochromní,
polychromazie a jiné
·
změny tvaru – celkově poikilocytóza (směs
různých tvarů erytrocytů), sférocyty, terčovité erytrocyty (target cells),
dakrocyty (erytrocyty tvaru kapky), anulocyty, schistocyty (fragmenty
erytrocytů), ovalocyty nebo eliptocyty (oválný tvar), akantocyty (erytrocyty
s ostrými, nepravidelnými výběžky plazmy), echinocyty (erytrocyty s
pravidelnými, zaoblenými výběžky), drepanocyty (srpkovité erytrocyty),
stomatocyty (projasnění ve středu erytrocytu tvaru úst), keratocyty (horned
cells = „rohaté“ buňky) a další.
·
přítomnost inkluzí – bazofilní tečkování,
Howell-Jollyho tělíska, Cabotovy prstence, Pappenheimerova tělíska
·
penízkovatění (rouleaux) – nelze hodnotit
v hustém nátěru
·
aglutinace
·
přítomnost parazitů
Trombocyty – hodnotíme
·
orientačně počet
·
velikost – normální, mikrotrombocyty,
makrotrombocyty, anizocytóza trombocytů,
·
přítomnost granulací – hypogranulární
trombocyty,
·
uložení v nátěru – shlukování –
trombocytární agregáty, satelitismus trombocytů
(trombocyty adherují nejčastěji na neutrofilní segmenty)
K záznamu hodnocení
leukocytů používáme hematologický počítač (leukomat).
Stručný popis postupu
1. provedení nátěru
2. barvení nátěru
3. hodnocení nátěru
4. vklad výsledku do LIS,
validace výsledku
Kalibrace a návaznost
nevyplněno.
Charakteristika
spolehlivosti
Vzhledem k
nerovnoměrnému rozložení buněk v nátěru je nutné zachovávat standardní postup
při prohlížení.
Dokumentace,
zpracování dat a vydávání výsledků
K vyšetření se připojuje slovní popis
zjištěných morfologických odchylek v jednotlivých krevních řadách.
Výsledky vyšetření zanesené
v LIS laboratoře se archivují v elektronické podobě.
Likvidace se
řídí skartačním řádem.
Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel
Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky
v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě na OKBH.
Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány
průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě
se svozem biologického materiálu.
Výsledková zpráva obsahuje:
·
identifikaci laboratoře, která výsledek vydala
·
odkaz
na akreditaci laboratoře
·
datum a čas vydání nálezu
·
jednoznačnou identifikaci pacienta
·
zdravotní
pojišťovnu pacienta
·
identifikaci
požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)
·
identifikaci
požadujícího lékaře (resp. oddělení)
·
diagnózu
pacienta
·
druh
biologického materiálu (sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)
·
jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření
·
datum a
čas přijetí vzorku laboratoří
·
datum a
čas odběru vzorku
·
výsledek
vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)
·
označení
akreditované metody
·
referenční
intervaly vyšetření
·
interpretaci výsledků, je-li to nutné
·
jiné
poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může
nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)
·
identifikaci
osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily
·
zkratky
identifikující žádanku
·
př.
20.BR-0777
·
20: den
v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku
·
př.
20.HH-0777
·
20: den
v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku
Záznamy o kontrole a údržbě zařízení se provádějí do
provozního deníku, Záznamy se autorizují a archivují.
Výsledky hodnocení
krevního nátěru se zaznamenávají do pracovního listu, autorizují a archivují
v místnosti pro mikroskopii. Sklíčka s nátěry PK se skladují 1 měsíc,
některé patologické nálezy dlouhodobě k edukaci pracovníků.
Referenční a varovná rozmezí
Referenční hodnoty u zdravé populace
s ohledem na věk dle doporučení ČHS.
Interpretace
výsledků, konzultační činnosti a hlášení
- Leukocytóza – zvýšený počet leukocytů. Výskyt u
infekční a zánětlivých on., leukemie, lymfoproliferativní on.,
myeloproliferativní on., otrav, popálenin, těhotenství, krvácení.
- Leukopenie – snížený počet leukocytů. Výskyt u
dřeňových útlumů, některé infekce, léčba imunosupresivy, leukemie
(HCL,APL..)
- Neutrofilie – zvýšený počet neutrofilů. Výskyt u
bakteriálních infekcí, zánětlivých on., myeloproliferativních on.,
těhotenství
- Neutropenie – snížený počet neutrofilů. Výskyt u
při poruchách imunity, u dřeňových útlumů, některých infektů, leukemie
- Agranulocytóza – snížení až vymizení granulocytů.
Výskyt u polékové agranulocytózy, dřeňové útlumy, protinádorová léčba,
leukemie
- Lymfocytóza – zvýšený počet lymfocytů. Výskyt u
virových infekcí, leukemie, lymfoproliferativní on.
- Lymfopenie – snížený počet lymfocytů. Výskyt u
některých infekcí, po ozáření, intoxikaci.
- Eozinofilie – zvýšený počet eozinofilů. Výskyt při
alergiích, parazitárních on., myeloproliferativních on.
- Bazofilie – zvýšený počet bazofilů. Výskyt u
alergií, CML.
- Monocytóza – zvýšený počet monocytů. Výskyt u MDS,
chronických inf., virových inf., leukemie
- Trombocytóza – sekundárně zvýšené hodnoty
trombocytů. Výskyt u zánětu, stresu, léčba kortikoidy, traumata, krvácení,
nádorová on., autoimunitní on.
- Trombocytemie – primárně zvýšené hodnoty
trombocytů. Výskyt u myeloproliferativních on.
- Tromobytopenie – snížený počet trombocytů. Výskyt u
imunosupresivní léčby, leukemie, lymfoproliferativní on.,
myeloproliferativní on., krvácení, protilátky proti trombocytům,
protinádorová léčba, alkoholizmus, plastická anémie, TTP, DIC, HUS, HIT,
HELLP syndrom, septické stavy, hypersplenismus
- Erytrocyty
Ø Snížené - anémie,
dřeňový útlum, leukemie, krvácení, lymfoproliferativní on., myeloproliferativní
on
Ø Zvýšené –
polyglobulie, polycytémie
Řízení
kvality
Požadavky na kontrolu kvality při
barvení a hodnocení krevních nátěrů prováděné denně: dle pracovní instrukce PI-OKBH-45 Barvení nátěrů periferní krve
Poznámky
Nevyplněno
Jiné související informace
Číslo metody v lokálním číselníku Klíč Název
750 BNSEG Neutrofilní segment
751 BNTYC Neutrofilní tyč
752 BMMC Metamyelocyt
753 BMYEL Myelocyt
754 BPMC Promyelocyt
755 BBE Blastický element
756 BEOS Eosinofil
757 BBASO Basofil
758 BMONO Monocyt
759 BLYMF Lymfocyt
760 BPLB Buňka plazmatická
761 BERBL Erytroblast
762 BPRLY Prolymfocyt
763 BLYBL Lymfoblast
764 BLYRE Lymfocyt reaktivní
765 BLYAT Lymfocyt atypický
768 BVAKU Vakuolizace
769 BGUMP Gumprechtovy stíny
770 BHJT Howell-Jollyho tělíska
771 BDOHL Döhleho inkluze
772 BTOXG Toxická granulace
773 JADSTI Jaderné stíny
775 BHT Heinzova tělíska
776 BHYPS Hypersegmentace
779 BSCH Schistocyty
Literatura
Pecka, M.: Přehled laboratorní hematologie I.,
Galén, 1995, s. 101-108.
Pecka, M.: Přehled laboratorní hematologie II., Galén,
1996, s. 58-62, 120-129.
Doporučení České hematologické společnosti ČLS JEP:
Příprava a barvení
nátěru periferní krve a aspirátu kostní dřeně, 2019
Postup při hodnocení
nátěru periferní krve 2019
Doporučení ČHS ČLS JEP
pro kontrolu kvality barvení krevních nátěrů metodou May-Grünwald-Giemsa 2019
Kontrola kvality
mikroskopického hodnocení rozpočtu leukocytů a morfologie buněk v nátěru
periferní krve, 2019
Doporučení ČHS ČLS JEP
„Referenční meze krevního obrazu, retikulocytů, normoblastů a diferenciálního
rozpočtu leukocytů u dětí, 2023
Doporučení ČHS ČLS JEP
„Referenční meze krevního obrazu, retikulocytů, normoblastů a diferenciálního
rozpočtu leukocytů dospělých, 2021
Appendixy
nevyplněno
Autorské
poznámky
nevyplněno
Recenze,
schválení
Autor:
Mgr. Kristýna Vlastová