PI-OKBH-45 Příprava a barvení nátěrů periferní krve, IKK

Dle doporučení ČHS, ČLS JEP-Příprava a barvení nátěru periferní krve a aspirátu kostní dřeně, 2019

Princip: Pappenheimova panoptická barvící technika

Panoptická barvicí technika je základní postup barvení v hematologii. Využívá k postupnému

barvení nátěrů:

§ roztok May-Grünwald – složení: eozin Y, metylenová modř, metylalkohol, glycerol,

§ roztoku Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azur-eozin, azur II, metylalkohol, glycerol.

Základem jsou:

• kationtové (zásadité) barvivo azur B, které se váže na aniontové části molekul a barví modrošedě DNA nebo RNA, nukleoproteiny, granule bazofilů a sekundární granula neutrofilů.

• aniontové barvivo eozin Y, které se váže na kationtové části molekul proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula.

Odběr a manipulace s biologickým materiálem:

Periferní krev odebraná do K₃EDTA, nativní aspirát kostní dřeně

Stabilita vzorku do zhotovení nátěru max. 5 hodin.

Uchovávání nátěru na skle:

• nefixovaný nenabarvený nátěr vhodné zpracovat do 5 hodin

• nabarvený nátěr PK uchováváme po dobu 1 měsíce

Tzv. rychlé barvení není vhodné k barvení nátěrů při hodnocení periferní krve.

Základní reagencie

-roztok May-Grünwald (Penta)

-roztok Giemsa-Romanowsky (Giemsa R Solution, Penta)

- uchovávat při laboratorní teplotě ve tmě, používat do data exspirace

-fosfátový pufr pH =7,0 (Buffer Solution f.Diagnostika a.s.)

- uchovávat při laboratorní teplotě, stabilita 4 týdny po rozpuštění

Postup:

1. Zhotovování krevních nátěrů:

§ Na podložní sklíčko nanést kapku krve z odběrové zkumavky.

§ Roztěrové sklíčko přiložit pod úhlem 30-40 ° před kapku, zhotovit nátěr rovnoměrným a lehkým pohybem směrem ke kapce a pak k opačnému konci podložního sklíčka. Nátěr musí být rovnoměrný, stejnorodý a přiměřeně tenký, musí mít dlouhé rovné okraje a na konci přecházet do ztracena, alespoň 1-2 cm před koncem sklíčka.

§ Hotový nátěr nechat min.10 min.na vzduchu dobře zaschnout, přičemž je nutné ho chránit před znečištěním prachem.

§ Sklíčko označit identifikačním číslem, datem a jménem pacienta

§ Nátěry krve ne sklíčku necháme 10 minut zaschnout při laboratorní teplotě a pak barvíme.

2. Barvení krevních nátěrů:

• Použít Pappenheimovu metodu panoptického barvení roztokem May-Grünwald a Giemsa-Romanowski.
• Podložní sklíčka s nátěry vložit do barvicí kyvety s neředěným May-Grünwaldovým roztokem (nesmí přijít do kontaktu s vodou) a fixovat 5 min., vyměňovat dle potřeby.
• Nátěry vložit do barvící kyvety s pufrem na 1 min., vyměňovat dle potřeby.
• Pak nátěry vložit do kyvety s ředěným roztokem Giemsa-Romanowski 1:20 s pufrem a barvit 10 min, připravovat denně čerstvý.
• Opláchnout pod mírným proudem tekoucí vody a nechat oschnout

Kontrola kvality:

Dodržování SOP H_Hodnocení nátěru PK

Požadavky na kontrolu kvality při hodnocení krevních nátěrů prováděné denně:

• dodržování standardních operačních postupů
• kontrola dodržení časových charakteristik (včasná fixace, délka barvení)
• používat čerstvě naředěné barvící roztoky, ne déle než 24 hod., kontrola dostatečného množství

roztoků v kyvetách, kyvety uzavírat

• dodržovat podmínky skladování (barvící roztoky uchovávat ve tmě, dodržovat teplotu) a dobu exspirace reagencií
• zamezení vlhkosti v roztocích
• kvalita skel (nepoužívat poškozená, zašpiněná, mastná skla)
• správné provedení nátěru (délka, šířka a síla)
• kontrola pufru-bez viditelných příměsí a změn
• kontrola po nabarvení nátěru s každou novou sérií barvících roztoků a v první sadě skel (1-2 skla), číslo kontrolního vzorku zaznamenat do formuláře F-OKBH-123 Příprava barev-dif.mikro,

záznamy autorizovat

1. Makroskopicky: - krevní nátěry mají být zbarveny purpurově

- je-li zbarvení do modra, pufr má vyšší pH nebo je přebarvený

- je-li zbarvení do růžova, pufr má nižší pH nebo je nátěr nedobarvený

2. Mikroskopický: erytrocyty růžovošedé

trombocyty tmavě růžové

leukocyty-jádra tmavě fialová

eozinofily-granula jasně oranžová

neutrolily a granulované lymfocyty-granula purpurová

bazofilní tečkování erytrocytů modré

• hodnocení nátěru se provádí dle SOP, na službách při prvozáchytu patologie v KO je nutné provést mikroskopické hodnocení nátěru PK,v případě nejasností kontaktujte EM,KV,GD
• výsledky hodnocení se zapisují do pracovního listu a autorizují

Při nedostatečné kvalitě je připravena nová barvící lázeň a zkontrolována opět zhotovením a zhodnocením

krevního nátěru.

Zbarvení nátěrů je dáno:

• Vlastním barvením a barvicími roztoky,
• Typem biologického materiálu (periferní krev, kostní dřeň, atd.)
• Vlastnostmi biologického materiálu (vysoký či nízký hematokrit, paraproteinémie, buněčnost)

Jestliže jsou na nátěrech patrné rozdíly v barvitelnosti buněk (viz výše) ve

stejném barvicím cyklu a ve stejné barvicí lázni, potom je barvení v pořádku a změny

v obarvení jednotlivých nátěrů jsou dány typem odebraného biologického materiálu (výsledek

barvení může být ovlivněn i buněčným složením).

Uchovávání nátěrů:

• Nenabarvené, nefixované – vhodné zpracovat do 5 hodin,
• Nenabarvené, fixované – je možné uchovávat po neomezenou dobu (nátěry periferní krve nejlépe po dobu 1 měsíce, aspiráty kostních dření po dobu 10 let),
• Nabarvené – je možné uchovávat po neomezenou dobu (nátěry periferní krve minimálně 7 dní, aspiráty kostních dření po dobu 10 let). Uchováváme po dobu 1 měsíce.

Pro uchovávání obarvených nátěrů je nezbytné zbavit nátěr imerzního oleje oplachem nebo otěrem (šetrný prostředek je např. ether nebo benzín lékařský).

Kontrola zařízení:

• 1x ročně validace a seřízení mikroskopu servisním technikem
• objektivy čistit po každém použití

Dokumentace:

• o kontrole zařízení provádět záznam do provozního deníku, záznam autorizovat
• záznam o kontrole kvality, přípravě barvících roztoků, fosfátového pufru, změně šarže zkoumadel a pufru provést do formuláře F-OKBH-123 Příprava barev-dif.mikro, záznam autorizovat

Zdroje chyb

§ Silný nátěr po celé délce skla.

• Sklo nebylo řádně odmaštěné (v nátěru jsou mastná oka).
• Sklo nebylo přikryté, je pokryté prachovými částicemi (nátěr je strakatý).
• Nátěr je ukončen silnou vrstvou a nepřechází „do ztracena“ (roztěrové sklo bylo při

ukončení nátěru prudce zvednuto).

• Nátěr s nerovnoměrně rozloženými jadernými buňkami (na roztěrové sklo se příliš

tlačilo, nátěr byl proveden pod tlakem, a proto může dojít k rozdrcení buněk, příp. bylo nekvalitní roztěrové sklo).

• Nesprávný sklon roztěrového skla (nesprávná hustota nátěru, roztěr nebyl proveden dle hodnot HCT).

Zdroje chyb při barvení:

• Kyselé pH způsobí růžové zbarvení nátěrů, zásadité pH modré zbarvení nátěrů.
• Dojde-li při oplachování nátěru k jeho „smytí“, znamená to, že nátěr nebyl dostatečně

zaschlý nebo fixovaný.

• Staré krevní nátěry či nátěry aspirátu KD bývají často přebarvené.
• Modré pozadí nátěru (mimo buňky) může být způsobeno

- nedostatečnou fixací,

- nedostatečným oplachem,

- dlouhodobým skladováním nefixovaného nátěru,

- přítomností patologických imunoglobulinů ve vzorku.

Vnitřní kontrola kvality mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve jednotlivých pracovníků:

• Jako referenční materiál se využívají nátěry PK použité v EHK.
• VKK se účastní všichni pracovníci, kteří provádí a jsou zodpovědní za mikroskopické hodnocení nátěru periferní krve.
• Výsledky každého pracovníka jsou zhodnoceny vůči vydaným výsledkům EHK, hodnocení pracovníků je zapsáno do formuláře F-OKBH-121 VKK pro mikroskopické hodnocení
• Výsledky společně s primárními daty jsou archivovány u vedoucího úseku

Externí hodnocení kvality (EHK)

4x ročně se laboratoř účastní cyklu zaměřeného na hodnocení rozpočtu leukocytů a hodnocení buněk v nátěru periferní krve a 2x ročně hodnocení nátěru periferní krve-fotografie.