OSN-SAbstraktOSN-E

Stanovení katalytické aktivity enzymu ALT v séru a v plazmě enzymaticky soupravou Roche Cobas ALTLP (IFCC) na analyzátoru Cobas 6000, modul c501.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentů a textůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK - OKBH

S-OKBH-005 Směrnice EHK

S-OKBH-019 Verifikace postupů měření

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Příbalový leták Roche Cobas ALTLP pro kvantitativní stanovení ALT, kat.č. REF04467388190

Příbalový leták pro Systémový kalibrátor Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190

Příbalový leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti Biorad,Liquichek^TM

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

sérum/plazma

ALT, Alaninaminotransferáza

Reagenční souprava: ROCHE ALTLP REF04467388190

Název v lokálním číselníku LIS: ALT

Klíč v lokálním číselníku LIS: ALT

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 23

Kód metody v analyzátoru:684

Název metody v analyzátoru: ALT

Seznam zdravotních výkonů VZP: 81621 ALT

81137 ALT STATIM

OSN-SPrincipOSN-E

Metoda je založená na doporučeních IFCC .

ALT katalyzuje reakci L-alaninu s 2-ketoglutarátem, při které dojde k transaminaci za vzniku L-glutamátu a pyruvátu:

ALT + P5P aktivovaná ALT

ALT ze vzorku

L-alanin   +   2-ketoglutarát      L-Glutamát   +   Pyruvát

 Pyruvát dále reaguje s NADH za katalýzy laktátdehydrogenázy. NADH se oxiduje na NAD⁺ a pyruvát se redukuje na laktát:

LDH v soupravě

Pyruvát   +   NADH   +   H⁺       L-Laktát   +   NAD⁺

Pokles absorbance NADH se sleduje fotometricky (kineticky) při 340/410 nm a je úměrný aktivitě enzymu ALT ve vzorku.

Endogenní pyruvát je odstraněn během inkubační periody (v první části reakce, před přidáním R2)

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřenímOSN-E

Stanovení aktivity ALT v séru patří mezi základní rutinní metody klinické biochemie. Indikací pro vyšetření

je celá řada: jaterní onemocnění, onemocnění žlučových cest, dekompenzované srdeční vady aj.

Stanovení nelze provést v hemolytickém séru, nevhodné je požití alkoholu a aplikace některých léků (penicilin, salicyláty, opiáty) před odběrem.

Je zapotřebí zaregistrovat i další důležité preanalytické informace o faktech, která mohou způsobit zvýšení či snížení ALT, např. fyzická aktivita (zvyšuje), věk (lehké zvýšení u dětí), hmotnost (zvýšení u obézních lidí), pohlaví (muži mají vyšší aktivitu než ženy), těhotenství (mírně snižuje), požití alkoholu (zvyšuje) a poloha při odběru (vleže je aktivita o 10-15% nižší)

ALT je cytoplazmatický enzym (polypeptid složený ze 495 aminokyselin, M_r=54 439). Vyskytuje se především v jaterních, ale i v srdečních, ledvinných a svalových buňkách. Při poškození těchto buněk nebo jen při zvýšení permeability buněčné membrány se dostává ve zvýšené míře do krve.  Patří mezi transferázy přenášející dusíkaté skupiny, konkrétně aminoskupinu. Podílí se tedy na metabolismu dusíku (transformace alfa-ketokyselin na aminokyseliny). Katalyzuje přenos aminoskupiny z  L-alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. V organismu se reakce uplatňuje při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin.

Jeho koenzymem je pyridoxalfosfát-derivát vitaminu B₆ (pyridoxin). V séru není tento koenzym přítomen vždy v dostatečném množství, takže přidá-li se k reakční směsi, dojde k zvýšení naměřených hodnot téměř

u všech sér, ale v různé míře (v průměru se zvýší o 20 %). 

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.

Plazma: Li-heparin, EDTA

Při odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr vzorku.

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vz

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až + 8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedenému v  LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce.

Interference sérum/plazma

Stanovení ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 106 µmol/l

Stanovení ovlivňuje koncentrace konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu, je- li >1026 µmol/l

Stanovení ovlivňuje lipémie je-li index L > 150

Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle příbalového letáku

+20 až +25°C: 3 dny, +2 až +8°C: 7 dnů,

OmezeníOSN-E

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků.

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti 2000 g (rcf) resp. 3333 ot/min.Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány. 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Biochemický analyzátor ROCHE Cobas 6000, c501

OSN-SReagencieOSN-E

Souprava pro biochemický analyzátor Cobas 6000, modul c 501 ALTLP - 275 testů

Diluent NaCl 9%

Výrobce soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim

Dodavatel soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4, 150 00 Praha - 5

reagencie	obsah reagencie
R1	TRIS pufr: 224 mmol/l pH 7,3 (při +37 °C) L-alanin: 1120 mmol/l Albumin (hovězí): 0,25% LDH (mikroorganismy): ³ 45mkat/l stabilizátory konzervans
R2	Pyridoxalfosfát: 730 mmol/l aditiva konzervans
R3	2-oxoglutarát: 94 mmol/l NADH: ³ 1,7 mmol/l aditiva konzervans

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici při teplotě +2 až + 8 °C

Stabilita: Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až + 8 °C.

Stabilita v analyzátoru: 12 týdnů, Diluent NaCl 9% 12 týdnů

Manipulace s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do analyzátoru bez úprav.

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Odběrové nádobky

Špičky k automatickým pipetám

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu Stand By dle návodu v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Silně chylózní vzorky běžně nezpracováváme. Jestliže lékař stanovení ALT požaduje, postupujeme podle návodu pro práci s LIPOCLEAR   PI-OKBH-04 Práce s LIPOCLEAR

OSN-SPracovní postupOSN-E

Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy: 9,0 µl     

Přesný popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Záznamy o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.

Denně, před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních sérových materiálech na dvou hladinách S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

V případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.

Vyhovuje-li naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků na posuvný pás Roche Cobas 6000, c501. Pokud je biologického materiálu málo přepipetuje se do Hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.

Pokud je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá automaticky.

Požadavky na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí klávesnice řídícího počítače analyzátoru.

Výsledky se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

1. Vloží se reagenční souprava.

2. V případě potřeby se provede kalibrace.

3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku, který se umístí na posuvný pás

4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY, stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.

5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.

OSN-SKalibrace a návaznost

Přesný popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Ke kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá Roche kalibrátor C. f.a.s., katalogové číslo 10759350190, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou hodnotou pro ALT.

Návaznost kalibrátoru:

Metoda je standardizována podle originální formulace IFCC použitím kalibrovaných pipet spolu s manuálním fotometrem. Stanovením absolutních hodnot a specifické absorptivity substrátu.

Příprava kalibrátoru:

Kalibrátor je dodáván v lyofilizovaném stavu.

Doporučený postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:

1.Opatrně otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost zabránění ztrátám lyofilizovaného materiálu zachyceného na gumové vložce.

2.Přidat do lahvičky přesně 3,0 ml deionizované vody.

3.Uzavřít gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do kompletního rozpuštění obsahu.

Stabilita:

Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až + 8 °C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený v lednici při +2 až + 8 °C. Alikvoty kalibrátoru se uchovávají v mrazáku při teplotě -20 °C po dobu max.30dní.

Vlastní kalibrace:

Ke kalibraci se používá výše uvedený kalibrátor. Typ reakce RATE (kinetická)

Kalibrace je 2-bodová, lineární a provádí se pomocí sérové matrice v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový bod je deionizovaná voda (tzv. reagenční blank).

Bezprostředně po provedení kalibrace se musí provést kontrola kvality.

Frekvence kalibrace: při změně šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie v přístroji.

Způsob dokumentace kalibračních dat:

Provedené kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací Cobas 6000/c501

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristika spolehlivosti z příbalového letáku.

Při stanovení ALT v séru, plazmě je oblast linearity 0,08– 11,70 µkat/l

Opakovatelnost (přesnost v sérii):

Sérum, plazma:

Opakovatelnost (n=21)	Průměr µkat/l	SD µkat/l	CV%
Precinorm U	0,70	0,01	1,3
Precipath U	2,07	0,01	0,5
Lidské sérum 1	2,03	0,01	0,6
Lidské sérum 2	0,12	0,02	12,9

Mezilehlá preciznost (mezi sériemi):

Mezilehlá preciznost	Průměr µkat/l	SD µkat/l	CV%
Precinorm U	0,70	0,01	1,6
Precipath U	2,07	0,02	1,0
Lidské sérum 3	0,04	0,01	2,9
Lidské sérum 4	2,03	0,07	3,6

Mez detekce:  0,08 µkat/l

Mez stanovitelnosti: výrobce neuvádí, odvozena z meze detekce 0,24 µkat/l

Korelace s jinou metodou: Hodnoty ALT získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917

Typ vzorku	Počet vzorků	Rovnice Passing/Bablok	Korelační koeficient	Rozmezí vzorku
sérum	198	Y=1,00x- 0,007	0,931	0,085 – 7,83 µkat/l

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu ALT v séru, plazmě pro analyzátor Roche Cobas 6000/ c 501.

Dokumentace, zpracování dat a vydávání výsledků

Hodnoty výsledků stanovení ALT v séru, plazmě se udávají na dvě desetinná místa v μkat/l.

Poznámka: Přepočet jednotek používaných pro ALT: U/l x 0.0167 = μkat/l.

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha je denně.

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

Výsledkový list obsahuje:

· identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

· odkaz na akreditaci laboratoře

· datum a čas vydání nálezu

· jednoznačnou identifikaci pacienta

· zdravotní pojišťovnu pacienta

· identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

· identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

· diagnózu pacienta

· druh biologického materiálu (např. sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

· jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

· datum a čas přijetí vzorku laboratoří

· datum a čas odběru vzorku,

· výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

· označení akreditované metody

· referenční meze

· interpretaci výsledků, je-li to nutné

· jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

· identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

· zkratky identifikující žádanku

př. 20.BR-0777

· 20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

· př. 20.HH-0777

· 20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-

Zdroj: příbalový leták

Sérum, plazma:

0-150 let, muži: 0,17-0,83 µkat/

0-150 let, ženy: 0,17-0,58µkat/l

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Zvýšení aktivity více než 50x bývá asociováno s akutní virovou hepatitidou, akutní jaterní nekrózou po intoxikacích (například paracetamol, tetrachlormethan).

Zvýšené hodnoty aktivity ALT v séru se nachází například u:

- akutní virové hepatitidy (ALT zvýšena již 3 dny před výskytem ikteru, vrchol 5. den po začátku onemocnění, průměrně bývá 50násobné zvýšení, pokles po 14 dnech, normalizace stavu za 6-8 týdnů)

- chronické hepatitidy (3-4 násobné zvýšení)

- akutního toxického poškození jater (až 100násobné zvýšení např. po požití, jedovatých hub, chlorovaných uhlovodíků, ale i alkoholu)

- infekční mononukleózy (max. 20násobné zvýšení)

- cirhózy

- sepse

- dekompenzované jaterní cirhózy (max. 4-5 krát vyšší aktivita, většinou nižší než AST)

- karcinomu jater (5-10 násobné zvýšení, ALT bývá vyšší než AST)

- metastáz do jater (pomalý vzestup)

- srdečního selhání - městnání krve v játrech (zvýšení 10 až 50krát)

- šoku (zvýšení více než 10krát)

- Reyově syndromu

- požití alkoholu

- aplikace některých léků (penicilin, salicyláty, opiáty)

Snížení aktivity ALT v séru provází deficit vitaminu B₆ (pyridoxinu)

Často se počítá poměr aktivit AST/ALT (tzv. de Ritisův kvocient), který slouží jako prognostický ukazatel.

Hodnoty > 1 signalizují závažnější poškození (nekróza hepatocytů).

Postup pro nahlášení kritické hodnoty výsledku laboratorního vyšetření je uveden ve směrnici S-OKBH-012 Směrnice pro vydávání výsledků.

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Ke kontrole a řízení kvality pro stanovení ALT v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy Biorad Liquid Assayed Multiqual se sérovou  matricí ve třech rozmezích koncentrace pro ALT měřené na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000/c501.

Příprava:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C.

Před použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny. Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány v lednici při +2 až +8 °C. Před použitím se opatrně alikvot promíchá pro zajištění homogenity vzorku kontroly.

Stabilita:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C, v tom případě jsou stabilní až do doby exspirace vyznačené na obale. Připravené alikvoty kontroly se uchovává v v lednici při +2 až +8 °C do spotřebování, nejdéle 1 týden.

Použití:

Měření kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci, po doplnění reagenci. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004 Směrnice pro IKK.

Dokumentace:

Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku.

Součástí kontroly a řízení kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí účastní nejméně 2x ročně.

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SJiné související informaceOSN-E

nevyplněno

OSN-SLiteraturaOSN-E

Young, D.S.: Effects of drugs on clinical laboratory tests. AACC, 5th ed. AACC Press, 2000. 

Racek, J. et al: Klinická biochemie. Galén, Praha, 2006, ISBN 80‑7262‑324‑9. 

Kolektiv autorů: Preanalytická fáze, Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP a SEKK, Pardubice, 2005, ISBN 80‑239‑5198‑X. 

Vnitřní materiály firmy Roche

Zima, T.: Laboratorní diagnostika, Galén, Praha 2007 

Kopáč, J.: Lékařská laboratorní diagnostika, Polygraf, Turnov, 2004 

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Pavlína Babičová