OSN-SAbstraktOSN-E

Kvantitativní stanovení volného tyroxinu (fT4) v lidském séru a plazmě metodou imunoelektrochemiluminiscence soupravou „ECLIA“ na imunochemickém analyzátoru Cobas 6000 (e 601 modul).

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

Skartační řád 

S-OKBH-003 Směrnice pro práci s biol. mater.

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK - OKBH

S-OKBH-005 Směrnice EHK

PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas 6000

Příbalový leták reagenční soupravy Elecsys fT4 IV reagent kit, kat.č. 09043276190 - 200 testů

Příbalový leták kalibrátoru fT4 II CalSet, kat.č. 09043292190

Příbalový leták konkrétního používaného kontrolního materiálu společnosti Biorad, Liquichek™ Immunoassay Plus Control

 

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

FT4, volný tyroxin, free T4

Reagenční souprava: Elecsys fT4 IV

Název v lokálním číselníku LIS: Thyroxin-volný

Klíč v lokálním číselníku LIS: FT4

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 71

Kód metody v analyzátoru e601: 302

Seznam zdravotních výkonů VZP: 93189

 

OSN-SPrincipOSN-E

Kompetiční princip. Celková doba stanovení 18 minut.

1. inkubace: 15 µl vzorku, monoklonální protilátka proti T4 značená rutheniovým komplexem

2. inkubace: Po přidání mikročástic, potažených streptavidinem a biotinylované T4 jsou dosud volná vazebná

místa značené protilátky obsazena, a vytváří se komplex protilátka-hapten. Celý komplex se váže na pevnou fázi prostřednictvím interakce mezi biotinem a streptavidinem.

Reakční směs je nasáta do měřicí komůrky, kde jsou mikročástice zachyceny magnetickým polem na povrchu elektrody. Nenavázané složky jsou odstraněny roztokem ProCell. Přivedené napětí na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je změřena fotonásobičem.

Výsledky jsou vyhodnoceny z kalibrační křivky, která je specifická pro přístroj a je vytvářena na základě dvoubodové kalibrace a základní master kalibrace, dodávané v čarovém kódu reagencie. 

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

 

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice S-OKBH-003 Směrnice pro práci s biol. mater. a směrnic VTN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

 

OSN-SFáze před vyšetřenímOSN-E

Tyroxin (T4) patří mezi aromatické aminokyseliny obsahující jod. Tyroxin (776,9 kDa) je základním hormonem, který je tvořen a vylučován štítnou žlázou. T4 je vylučován v závislosti na koncentraci hypofyzárního thyreostimulačního hormonu (TSH).

T4 cirkuluje reversibilně vázaný na transportní bílkoviny, zejména thyroxin vážící globulin (TBG) a z malé části na prealbumin a albumin (TBPA). Pouze asi 0,05 % T4 není vázáno na proteiny a tento volný thyroxin je metabolicky aktivní a stává se prekursorem pro tvorbu T3. Vázaný T4 je metabolicky inaktivní a funguje jako rezerva.

T4 a T3 jsou nezbytné pro růst a vývin organizmu. Hypotalamus velmi citlivě reaguje na množství hormonů štítné žlázy přítomných v krvi. Když hladina hormonů T4 a T3 v krvi klesne pod určitou úroveň, uvolní hypotalamus neurosekret tyreoliberin (TRH), který stimuluje adenohypofýzu. Z adenohypofýzy se uvolňuje do krevního oběhu tyreotropin (TSH), který stimuluje štítnou žlázu k syntéze a produkci většího množství hormonů. Když je hladina T4 a T3 dostatečná, sníží hypofýza sekreci TSH a štítná žláza redukuje množství vylučovaných hormonů. Zastavení nebo snížení funkce štítné žlázy při produkci hormonů vede k těžkým poruchám ve vývoji a růstu (kretenismus) u vyvíjejících se organizmů. V dospělém organizmu hormony štítné žlázy ovlivňují celkový metabolismus.

 

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.

Plazma: Li-, Na-, NH4+ -heparin, K3-EDTA, citran sodný a fluorid sodný/oxalát draselný.

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při 2-8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedeném v LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření. V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce.

Interference

Stanovení neovlivňuje hemolýza (koncentrace hemoglobinu < 2,0 g/dl), koncentrace bilirubinu (< 701 μmol/l), lipémie (< 2000 mg/dl), koncentrace biotinu (< 100 ng/ml). Interference nebyla zaznamenána od revmatoidních faktorů do koncentrace 339 IU/ml.

Stabilita analytu v séru

+20 až +25°C: 12 hodin, +4 až +8°C: 2 dny, - 20°C: 1 měsíc, zamrazit pouze jednou, nerozmrazovat při vysoké teplotě.

 

OSN-SOmezeníOSN-E

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole Kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků. Vzorky, které byly stabilizovány azidem sodným, nemohou být použity. Zvláštní pozornost je třeba věnovat pacientům léčeným biotinem, myšími monoklonálními protilátkami a pacientům s vysokým titrem protilátek proti rutheniu. U pacientů, kteří dostávají vysoké dávky biotinu (např. >5 mg/den), mohou být vzorky odebrány nejdříve za 8 hodin po podání poslední dávky biotinu.

 

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při 4 000 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány.

 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Imunochemický analyzátor firmy Roche Cobas 6000

 

OSN-SReagencieOSN-E

Elecsys fT4 IV reagent kit, kat.č. 09043276190 - 200 testů

Výrobce soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim

Dodavatel soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 3336/4, 150 00 Praha

 

M         Mikročástice potažené streptavidinem (průsvitné víčko), 1 nádobka, 12 ml:

Mikročástice potažené streptavidinem 0,72 mg/ml, vazebná kapacita 470 ng biotinu/mg mikročástic, konzervační látka.

R1        Anti-T4-Ab~ Ru(bpy)32+ (šedivé víčko), 1 nádobka, 18 ml:

Polyklonální anti-T4 protilátka (ovčí) značená rutheniovým komplexem 50 ng/ml, fosfátový pufr‑100 mol/l pH 7,0, konzervační látka.

R2        T4~biotin (černé víčko), 1 nádobka, 18 ml: Biotinylovaná T4 2,5 ng/ml, fosfátový pufr 100 mmol/l pH 7,0, konzervační látka.

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici ve vzpřímené poloze při teplotě +2 až +8°C.

Před založením do přístroje jsou 1 hodinu temperovány při laboratorní teplotě.

Stabilita: Činidla jsou stabilní do vyznačené doby exspirace při +2 až +8°C, po otevření při +2 až +8°C

po dobu 12 týdnů, po založení do přístroje po dobu 8 týdnů. 

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

Způsob likvidace: Likviduje se běžným způsobem podle místních předpisů.

Manipulace s reagenciemi: Reagencie v setu jsou sestaveny tak, že jsou připraveny k použití a nesmí být

oddělovány. Všechny informace potřebné pro přesnou činnost jsou načteny automaticky z čárového kódu reagencie.

 

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

04880340 ProCell M, 2x2l systémový pufr

04880293 CleanCell M, 2x2l čistící roztok pro měřící komůrku

03005712 ProbeWash M, 12x70 ml čistícího roztoku pro finalizaci a mytí během změny reagencií

12102137 Assay Cups/Assay Tips Combimagazine M, 48 palet: 84 reakčních nádobek a pipetovacích špiček, odpadní vaky

03004899 PreClean M

 

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu Standby podle pracovní instrukce PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas e601. Provede se údržba požadovaná softwarem přístroje. Vytemperovaný reagenční set Elecsys fT4 IV se umístí do reagenčního kruhu a uvolní se uzávěry do pracovní polohy.

 

OSN-SPracovní postupOSN-E

Před začátkem provozu se provede kontrola stavu reagencií a spotřebního materiálu a v případě potřeby se doplní. V případě založení nového reagenčního setu fT4 se provede před vlastním měřením vzorků kontrola kvality v kontrolním materiálu Biorad Imunoassay Plus Control na hladině 1, 2 a 3. Vyhovuje-li naměřený výsledek (podrobněji Řízení kvality), je možné přistoupit k zakládání vzorků do přístroje. Vzorky jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a vkládány do analyzátoru v šedých stojáncích v primárních zkumavkách s čárovým kódem. Pokud je biologického materiálu málo nebo obsahuje sraženinu, přepipetuje se do Hitachi cupu, který se umístí na zkumavku s čárovým kódem. Analyzátor pomocí systému LIS načte podle čárového kódu potřebné požadavky, provede příslušná stanovení a výsledky vypíše na obrazovku analyzátoru Workplace. Pipetuje se 16 μl vzorku. Výsledná koncentrace je vyhodnocena z kalibrační křivky specifické pro přístroj. Vzorky s koncentrací vyšší než rozsah měření, nesmí být ředěny. Výsledky jsou automaticky odesílány do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

V průběhu dne obsluha analyzátoru doplňuje spotřební materiál přístroje - špičky a cupy, roztoky ProCell, ClenCell, PreClean, ProbeWash a likviduje odpadní materiál.

Kontrola kvality se provádí denně, dále po každé kalibraci, při výměně setu stejné šarže a v dalších případech indikovaných vedoucím úseku. Externí kontrola kvality je prováděna 2x ročně.

Kalibrace je prováděna kalibračním materiálem fT4 CalSet firmy Roche, vždy u nové šarže a dále podle potřeby.

Odpadní materiál (špičky a microcupy) je průběžně likvidován podle vnitřních hygienických předpisů. Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí PI-OKBH-17 Manuál analyzátoru Cobas 6000.

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

1.     Vloží se reagenční souprava

2.     V případě potřeby se provede kalibrace.

3.     Vloží se analyzované vzorky do analyzátoru.

4.     Spustí se analýza.

5.     Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému Openlims, kde jsou kontrolovány.

 

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Ke kalibraci Elecsys FT4 testu je používán fT4 IV CalSet, obsahující pufr/proteinovou matrix s L-tyroxinem ve dvou koncentracích. Každý FT4 IV reagent set je označen čárovým kódem, který obsahuje specifické informace potřebné pro kalibraci jednotlivých šarží reagencií. Předdefinovaná kalibrační master křivka je adaptována na daný analyzátor použitím Elecsys FT4 IV CalSet.

Příprava: Kalibrátor je připraven k použití. Před prvním použitím se kalibrátor rozpipetuje po 300 μl

a uchovává se při 2-8oC.

Stabilita: Kalibrátor je stabilní do data exspirace uvedeného na obalu při teplotě skladování +2 až +8°C,

po rozpipetování 12 týdnů při teplotě +2 až +8°C.

Vlastní kalibrace: Kalibrace se provádí vždy při založení nové šarže reagenčního setu a dále podle potřeby

v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality. Nádobky s roztoky Cal1 a Cal2 se založí do černého stojánku, nechají vytemperovat na laboratorní teplotu, v analyzátoru se zadá příslušný požadavek a odstartuje se kalibrace. Výpočet je zajištěn prostřednictvím softwaru analyzátoru.

Ověření kalibrace: Není nutné. Software přístroje automaticky kontroluje validitu křivky a upozorní

na jakékoliv odchylky.

Návaznost: Tato metoda byla standardizována podle metody Elecsys fT4 III, která má návaznost na

Enzymun-Test FT4. Ta byla standardizována rovnovážnou dialýzou.

Způsob dokumentace kalibračních dat: Hodnoty kalibrací se uchovávají v paměti přístroje. Výsledky každé

kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací.

 

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristiky spolehlivosti z příbalového letáku:

Měřící rozsah: 0,300 – 100,0 pmol/l

Opakovatelnost (přesnost v sérii): CV 1,4 – 2,0 % dle hladiny

Mezilehlá preciznost (mezi sériemi): CV 2,6 – 4,8. % dle hladiny

Mez detekce: 0.30 pmol/l

Mez stanovitelnosti: 0,9 pmol/l

Analytická specifita - zkřížená reaktivita: Pro použité protilátky byly nalezeny následující zkřížené reakce:

D-T3 1,38 %, L-T4 a D-T4 100 %, L-T3 1.53%3-jodo-L-tyrozin 0.002 %, 3,5-dijodo-L tyrozin 0.01%, 3,3´,5,5´‑tetrajodothyreoacetát 38.5%. Stanovení nelze použít u pacientů, kterým jsou podávány hypolipidemika obsahující D-T4. Před vyšetřením funkce štítné žlázy takovýchto pacientů by měla být napřed přerušena terapie na 4-6 týdnů, aby se ustálil fyziologický stav.

Autoprotilátky proti hormonům štítné žlázy mohou ovlivňovat stanovení.

Anomálie vazebních bílkovin pozorované u FDH (familiární dysalbuminemická hyperthyroxinemie) mohou způsobovat hodnoty lišící se od očekávaných výsledků.

Porovnání metod:

Elescys FT4 x Enzymun-Test FT4 (n=314)

Passing/Bablok                      Lineární regrese

y=1,03x+0,39                          y=1,01x+0,63

T=0,900                                   r=0,987

SD (md68) =0,518                   Sy.x=0,836

 

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu fT4.

 

OSN-SDokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému.

Hodnoty výsledků se udávají na dvě desetinná místa v pmol/l.

 

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

 

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

 

Výsledková zpráva obsahuje:

·         identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

·         odkaz na akreditaci laboratoře

·         datum a čas vydání nálezu

·         jednoznačnou identifikaci pacienta

·         zdravotní pojišťovnu pacienta

·         identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

·         identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

·         diagnózu pacienta

·         druh biologického materiálu (sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

·         jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

·         datum a čas přijetí vzorku laboratoří

·         datum a čas odběru vzorku

·         výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

·         označení akreditované metody

·         referenční intervaly vyšetření

·         interpretaci výsledků, je-li to nutné

·         jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

·         identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

·         zkratky identifikující žádanku

·         př. 20.BR-0777

·         20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

·         př. 20.HH-0777

·         20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

 

OSN-SReferenční a varovná rozmezíOSN-E

Referenční rozmezí:

·         0 – 6D: 11,00 – 32,00 pmol/l

·         6D – 3M: 11,50 – 28,30 pmol/l

·         3M – 1: 11,90 – 25,60 pmol/l

·         1 – 6: 12,30 – 22,80 pmol/l

·         6 – 11: 12,50 -21,50 pmol/l

·         11 – 20: 12,60 – 21,00 pmol/l

·         20 -150: 12,00 – 22,00 pmol/l

 

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Poruchy v produkci hormonů štítné žlázy se projevují v bazálním metabolismu: při hyperfunkci (hypertyreóza, Morbus Basedowi) je produkce hormonů štítné žlázy zvýšena, při hypofunkci (myxedém) je snížena. U zdravých jedinců je T4 přítomen v plazmě přibližně v padesátinásobně vyšší koncentraci ve srovnání s koncentrací trijodthyroninu (T3). Vzhledem k ovlivnění funkce štítné žlázy TSH se na hladině T4 odrazí i poruchy funkce hypofýzy a hypothalamu.

Koncentrace volného thyroxinu, lépe než celkového, koreluje s klinickým thyroidním stavem, a u abnormálních koncentrací celkového thyroxinu tak lze zjistit, zda příčinou je porucha funkce štítné žlázy nebo změna v koncentraci transportního proteinu.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Jako kontrolní materiál se používá Liquichek Immunoassay Plus Control firmy Biorad.

Příprava: Kontrolní materiál je uchováván při -20oC. Po rozmražení a vytemperování na laboratorní teplotu je

připraven k použití. Pipetuje se do Hitachi cupu. Měření se provádí v bílém stojánku.

Stabilita: Kontrolní materiál je stabilní při -20°C do data exspirace vyznačené na obalu. Po rozmražení je

stabilní 4 týdny při +2 až +8°C. Kontrolní materiál není možné opakovaně zamrazovat.

Použití: Měření kontrolního materiálu se provádí denně střídavě na jedné ze tří hladin, dále po každé

kalibraci a při výměně setu stejné šarže. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S‑OKBH-004 Směrnice pro IKK. Externí kontrola kvality v rámci České republiky je organizována společností SEKK, laboratoř se jí účastní 2x ročně.

Dokumentace: Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí

disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucí úseku.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Hana Valentová