Abstrakt
Kvantitativní
stanovení celkového bilirubinu v séru, plazmě soupravou ROCHE BILT3 na
biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000 modul c501.
Seznam souvisejících dokumentů a textů
Laboratorní příručka
Příručka kvality
Provozní řád
S-OKBH-005 Směrnice EHK
S-OKBH-004 Směrnice pro IKK
S-OKBH-019 Verifikace postupů měření
PI-OKBH-18
Manuál analyzátoru Cobas c501/6000
PI-OKBH-04 Práce s LIPOCLEAR
Příbalový leták Roche Cobas BILT3 pro kvantitativní stanovení BIL kat.č.
REF05795397190
Příbalový leták pro Systémový kalibrátor Roche C.f.a.s., katalogové
číslo 10759350190
Příbalový leták konkrétního
používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti Biorad,LiquichekTM
Kódy a názvy v
různých klasifikačních systémech
BILI celk, celkový bilirubin, TBIL, Total Bilirubin, Bilirubin
celkový, Bili, TBi, TBILC
Reagenční souprava: ROCHE BILT3 kat.č. REF05795397190
Název v
lokálním číselníku LIS: Bilirubin
Klíč v lokálním číselníku LIS: BILT
Číslo metody v lokálním číselníku LIS:
16
Kód metody v analyzátoru: 712
Název metody v analyzátoru: BIL
Seznam zdravotních výkonů VZP: 81361 Celkového bilirubinu
81121
celkového bilirubinu STATIM
Princip
Stanovení bilirubinu je založeno
na reakci bilirubinu s diazoniovou solí 3,5- dichlorfenyl diazonium v silném
kyselém prostředí za vzniku červeného azobilirubinu. Intenzita zabarvení je
přímo úměrná koncentraci celkového bilirubinu ve vzorku a je stanovena měřením
nárůstu absorbance.
kyselé prostředí
Bilirubin
+ diazoniový iont
Azobilirubin
Místo provádění postupu
OKBH, úsek biochemický, Nemocnice
AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice
Bezpečnostní aspekty
Je nutné dodržovat obecné zásady
bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s
biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní
hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně),
při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku
především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním
krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut.
Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži
omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným
mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2
litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.
Fáze před vyšetřením
Stanovení bilirubinu v séru,
plazmě patří mezi základní biochemická vyšetření.
Celkový bilirubin je součtem frakce nekonjugovaného (nepřímého) a
konjugovaného (přímého) bilirubinu.
Řada nemocí ovlivňuje jeden či více kroků zahrnutých do tvorby, příjmu,
uskladnění, metabolismu a exkrece bilirubinu. Dle typu onemocnění se zvyšuje
buď nekonjugovaný nebo konjugovaný bilirubin nebo se podílejí na výsledné
hyperbilirubinémii oba.
Denně vzniká u dospělého jedince 4,3-5,1 mmol (250-300 mg) bilirubinu.
80-85% denní produkce bilirubinu je původem
z hemoglobinu uvolněného z rozpadlých zestárlých erytrocytů a
zbývajících 15-20% vzniká z rozpadu hem-obsahujících proteinů, např.
myoglobin, cytochrom, katalázy a z kostní dřeně jako výsledek erytropoézy.
V buňkách působí bilirubin toxicky, pravděpodobně rozpojením oxidativní
fosforylace.
Metabolismus bilirubinu lze rozdělit na
několik úseků: vznik, transport v krvi, vychytávání v játrech,
intrahepatocytový transport, konjugace s kyselinou glukuronovou, sekrece
žlučovým pólem, gastrointestinální metabolismus a vyloučení metabolitů z
organismu.
V krevním oběhu se bilirubin nespecificky
váže na albumin (možnost kompetitivní vazby mastných kyselin, lipofilních léků
apod.). Bilirubin-albuminový komplex neproniká nepoškozenou hematoencefalickou
bariérou, na rozdíl od volného bilirubinu (důležité u novorozeneckých
žloutenek). Samotný bilirubin je ve vodě (plazmě) nerozpustný,
bilirubin-albuminový komplex se nazývá nekonjugovaný bilirubin.
Aby mohl být bilirubin z organismu
vyloučen, musí být dopraven z míst svého vzniku do hepatocytů.
V jaterní buňce se bilirubin naváže na dva
druhy transportních proteinů: ligandin (glutahion-S-transferasa) nebo protein
Z, které ho přenesou do hladkého endoplazmatického retikula. Mikrosomální
bilirubin - UDP-glukuronyltransferáza v membránách retikula katalyzuje
konjugaci bilirubinu s kyselinou glukuronovou na bilirubin mono-a diglukuronid
(90%). Tak vzniká tzv. konjugovaný bilirubin. Ten se dostává aktivním
transportem přes membránu hepatocytu do žlučových kapilár a je vylučován žlučí
do duodena. Ve střevě je působením b-glukuronidasy dekonjugován a částečně
vstřebáván zpět do portálního oběhu a znovu zachycen hepatocyty
(enterohepatální oběh). Další část je střevní mikrobiální flórou hydrogenována
na tři bezbarvé tetrapyroly společně nazývané urobilinogeny. Asi 20 %
urobilinogenů je zpětně vstřebáváno do jater, asi 2-5 % se dostává do periferní
cirkulace a je vylučováno ledvinami do moče. Nevstřebané urobilinogeny se
v tlustém střevě samovolně oxidují na hnědě zbarvené pigmenty:
sterkobilin, mesobilin a urobilin. Vyloučené množství činí 70 - 470 mmol/den (40 - 280
mg/den).
Eliminace přímého bilirubinu je téměř úplná,
a proto je jeho normální hladina v plazmě nízká.
Hyperbiliruminémie:
·
nemoci
pre-hepatálního původu s převahou nekonjugovaného bilirubinu
při hyperbilirubinémii, včetně korpuskulární hemolytické anémie,
thalasémie a srpkovité anémie,
·
extrakorpuskulární
hemolytické anémie vzniklé po transfúzi např. jako důsledek reakce na
nekompatibilitu podané krve v AB0 nebo Rh systému s příjemcem;
·
novorozenecká
žloutenka a hemolytické nemoc novorozenců.
nekonjugovaná - Crigler-Najjarův syndrom,
Gilbertův syndrom a konjugovaná např. Dubin-Johnsonův syndrom a Rotorův
syndrom.
Odběr primárního
vzorku a transport
Odběr
Sérum: Odběr se provádí standardním
způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky
s aktivátorem
srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému.
Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je
vhodný odběr ráno.
Plazma: Li-heparin, K3-EDTA
Při odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr vzorku.
Transport
Transport
materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici
S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.
Skladování
Sérum/plazma je na OKBH po provedení
analýzy skladováno v lednici při +2 až +
V případě delšího skladování
pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě
Interference
Stanovení ovlivňuje hemolýza je-li
koncentrace hemoglobinu > 497 µmol/l, u novorozenců, je-li koncentrace hemoglobinu
> 621 µmol/l
Stanovení ovlivňuje lipémie je-li index L
> 1000
Stabilita
měřené veličiny v séru a plazmě dle příbalového letáku
+15 až +25°C: 1
den, +2 až +8°C: 7 dnů, 6 měsíců
při -20
Omezení
Laboratoř může odmítnout
přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů
uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo
odmítnutí primárních vzorků.
Manipulace se
vzorky
Vzorky
je nutno chránit před světlem.
Manipulace se vzorky probíhá
podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených
v Laboratorní příručce a Příručce kvality.
Primární zkumavka
s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti
Přístroje a
pomůcky
Centrifuga
Analyzátor Cobas 6000, modul c501
Reagencie
Souprava pro biochemický analyzátor Cobas c 501 BILT3 - 250
testů
Diluent NaCl 9%
Výrobce soupravy:
Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim
Dodavatel
soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics
division, Na Valentince 336/4 , 150 00 Praha - 5
reagencie |
obsah reagencie |
R1 |
Fosfát: 50 mmol/l pH 1,0 detergenty konzervans |
R2 |
3,5- dichlorfenyl diazoniová sůl ³
1,35 mmol/l konzervans |
Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici při
teplotě +2 až +
Stabilita: Neotevřené reagencie jsou stabilní do
označené doby exspirace při +2 až +
Stabilita v analyzátoru: 6 týdnů, Diluent NaCl 9 % 12 týdnů
Manipulace s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do
analyzátoru bez úprav.
Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly
kvality.
Spotřební
materiál
Odběrové nádobky
Špičky k automatickým pipetám
Příprava
k činnosti
Přístroj se uvede do stavu STAND
BY dle návodu v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Silně chylózní vzorky běžně
nezpracováváme. Jestliže lékař stanovení bilirubinu požaduje, postupujeme podle
návodu pro práci s LIPOCLEAR PI-OKBH-04
Práce s LIPOCLEAR.
Pracovní postup
Množství pipetovaného vzorku
séra, plazmy: 2,0 µl
Přesný popis analýzy včetně
ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru
Cobas c501/6000.
Záznamy o pravidelné údržbě
analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.
Denně, před vlastním měřením
vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních sérových materiálech na
hladině dvou hladinách. S-OKBH-004 Směrnice pro IKK.
V případě, že výsledky
kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému tolerančnímu rozmezí, musí se
nalézt a odstranit závada, eventuálně provést nová kalibrace a následně
zopakovat kontrola kvality.
Vyhovuje-li naměřený výsledek
očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit k vkládání
vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou kontrolovány na
přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků na posuvný
pás Roche Cobas 6000. Pokud je biologického materiálu málo, přepipetuje se do
Hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.
Pokud je analyzátor ve stavu
STAND BY, stiskneme ikonu START v základní obrazovce řídícího počítače pro
zahájení analýzy, která dále probíhá automaticky.
Požadavky na analýzy se do
analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím laboratorního
informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí klávesnice
řídícího počítače analyzátoru.
Výsledky se z analyzátoru automaticky
přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.
Obsluha analyzátoru se řídí
vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní
instrukcí
PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Stručný popis
postupu
1. Vloží se reagenční souprava.
2. V případě potřeby se provede kalibrace.
3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku, který se umístí na
posuvný pás
4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY, stiskne se ikona START a tím se
zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.
5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému
LIS, kde jsou kontrolovány.
Kalibrace a návaznost
Přesný
popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000
Ke kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor
C.f.a.s., kat.č. 10759350 190, který je připraven z lidských sér
s chemickými aditivy a příslušnými enzymy lidského, zvířecího a
rostlinného původu s deklarovanou hodnotou pro BILIRUBIN.
Návaznost
kalibrátoru:
Metoda je
standardizovaná dle Doumasovy metody.
Příprava
kalibrátoru:
Kalibrátor je dodáván v lyofilizovaném stavu.
Doporučený postup rekonstituování lyofilizovaného
kalibrátoru:
1.Opatrně otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom
věnovat maximální pozornost zabránění
ztrátám lyofilizovaného materiálu zachyceného na gumové vložce.
2.Přidat do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione
Braun.
3.Uzavřít gumovou vložkou a po 30
minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do kompletního rozpuštění obsahu.
Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do doby exspirace
vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až + 8°C. Otevřený a
rekonstituovaný materiál je stabilní 1 den uložený v lednici bez přístupu
přímého světla při +2 až +
Vlastní kalibrace:
Kalibrace je 2-bodová,2-Point-End.Lineární a provádí se
pomocí sérové matrice v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový
bod je deionizovaná voda tzv. reagenční blank.
Bezprostředně po provedení kalibrace se musí provést kontrola kvality.
Frekvence kalibrace:
Provádí se při změně šarže
reagencie a dále podle potřeby v souvislosti s vyhodnocováním
kontroly kvality a stability kalibrace reagencie v přístroji.
Způsob dokumentace kalibračních dat: Provedené kalibrace se
uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace jsou vytištěny a
založeny do dokumentace kalibrací Roche cobas c501.
Charakteristika
spolehlivosti
Charakteristika spolehlivosti
z příbalového letáku
Rozsah měření v séru, plazmě:
Při stanovení
bilirubinu v séru, plazmě je oblast linearity 2,5– 650 µmol/l
Opakovatelnost
(přesnost v sérii):
Sérum, plazma:
Opakovatelnost (n=21) |
Průměr [mmol/l] |
SD [mmol/l] |
CV [%] |
Hladina kontroly 1 |
15,4 |
0,3 |
2,1 |
Hladina kontroly 2 |
52,8 |
0,3 |
0,6 |
Lidské sérum A |
8,69 |
0,25 |
2,9 |
Lidské sérum B |
302 |
2 |
0,6 |
Lidské sérum C |
544 |
2 |
0,4 |
Reprodukovatelnost (mezi sériemi):
Mezilehlá přesnost |
Průměr [mmol/l] |
SD [mmol/l] |
CV [%] |
Hladina kontroly 1 |
15,4 |
0,3 |
2,1 |
Hladina kontroly 2 |
52,8 |
0,4 |
0,8 |
Lidské sérum A |
8,69 |
0,29 |
3,3 |
Lidské sérum B |
302 |
2 |
0,8 |
Lidské sérum C |
544 |
3 |
0,6 |
Mez detekce: 2,5
µmol/l
Mez stanovitelnosti:
2,5 µmol/l
Korelace s jinou metodou: Hodnoty BILIRUBINU získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly
porovnány s hodnotami stanovenými použitím odpovídající reagencie na
analyzátoru Cobas Integra 800.
Typ vzorku |
Počet vzorků |
Rovnice Passing/Bablok |
Korelační koeficient |
Rozmezí vzorku |
sérum |
64 |
Y=0,995x- 0,734 |
0,990 |
3,6– 618 µkat/l |
Aktuální charakteristiky spolehlivosti:
Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou
uvedeny v platném verifikačním protokolu BILIRUBINU v séru, plazmě
pro analyzátor Roche cobas c 501.
Dokumentace,
zpracování dat a vydávání výsledků
Hodnoty výsledků stanovení
celkového bilirubinu v séru, plazmě se udávají na jedno desetinné místo,
v µmol/l
Poznámka: Přepočet
starších jednotek používaných dříve pro celkový bilirubin: mg/dl x 17,1 = µmol/l.
Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další
pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk.
Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním
informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha.
Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice
Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici
elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového
okna v laboratoři.
Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány
průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě
se svozem biologického materiálu.
Výsledkový
list obsahuje:
·
identifikaci
laboratoře, která výsledek vydala
·
odkaz na akreditaci laboratoře
·
datum
a čas vydání nálezu
·
jednoznačnou
identifikaci pacienta
·
zdravotní pojišťovnu pacienta
·
identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)
·
identifikaci požadujícího lékaře (resp.
oddělení)
·
diagnózu pacienta
·
druh biologického materiálu (např. sérum, plazma,
moč, krev u vyšetření krevního obrazu)
·
jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření
·
datum a čas přijetí vzorku laboratoří
·
datum a čas odběru vzorku,
·
výsledek vyšetření s odpovídajícími
jednotkami (nejčastěji SI jednotky)
·
označení akreditované metody
·
referenční meze
·
interpretaci
výsledků, je-li to nutné
·
jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost
primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek
požadovaného vyšetření)
·
identifikaci osob, které výsledkovou zprávu
kontrolovaly a schválily
·
zkratky identifikující žádanku
př. 20.BR-0777
·
20: den v měsíci, BR: biochemie rutina,
0777: číslo vzorku
·
př. 20.HH-0777
·
20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777:
číslo vzorku
Referenční a
varovná rozmezí
·
18 – 150: 21 μmol/l, zdroj: PL
·
1M – 18R: 17 μmol/l, zdroj: PL
·
0 – 2D: 100 μmol/l, zdroj: ÚPMD
·
2D – 3D: 120 μmol/l, zdroj: ÚPMD
·
3D – 5D: 205 μmol/l, zdroj: ÚPMD
·
5D – 1M: 40 μmol/l, zdroj: ÚPMD
Interpretace výsledků, konzultační
činnosti a hlášení
Příčiny zvýšených hodnot
celkového bilirubinu |
·
jaterní nedostatečnost: hepatitida, cirhoza |
·
extrahepatální obstrukce |
·
hemolytické poruchy |
·
novorozenci – příčiny rozličné včetně novorozenecké žloutenky |
·
Gilbertova nemoc (enzymový defekt) |
Příčinou převážně nekonjugovaných
hyperbilirubinémií je zvýšený rozpad hemoglobinu (hemolytické anémie), kdy
kapacita jater nestačí transportovat zvýšenou produkci bilirubinu do žluče
(tzv. prehepatální hyperbilirubinémie), nebo snížené vychytávání bilirubinu
jaterní buňkou a poruchy jeho konjugace kyselinou glukuronovou.
Příčinou zvýšení konjugovaného i
nekonjugovaného bilirubinu současně (smíšené hyperbilirubinémie) je
poškození hepatocytů, ať už původu virového (akutní hepatitidy, jiná virová či
bakteriální onemocnění) nebo při poškození jater toxiny (alkohol, muchomůrka
zelená, bakteriální toxiny, chloroform, tetrachlórmetan).
Příčinou striktně konjugované
hyperbilirubinémie je buď extrahepatální obstrukce, nebo poruchy exkrece
konjugovaného bilirubinu jaterní buňkou (Dubinův-Johnsonův syndrom, Rotorův
syndromu) poléková cholestáza a primární biliární cirhóza.
Monitorování
koncentrace bilirubinu u novorozenců, zejména nedonošených, má mimořádný
význam. Přeměna bilirubinu u nich ještě není zcela vyvinuta, proto se u nich
nekonjugovaný bilirubin může hromadit a vyvolat tzv. novorozeneckou žloutenku.
Její nebezpečí tkví v tom, že nekonjugovaný bilirubin, který není vázán na
albumin, proniká snadno do lipofilních mozkových buněk a může je nevratně
poškodit. Aby mohl být bilirubin z organismu vyloučen, musí být dopraven
z míst svého vzniku do hepatocytů. V krevním oběhu se nespecificky váže na
albumin (možnost kompetitivní vazby mastných kyselin, lipofilních léků apod.).
Bilirubin-albuminový komplex neproniká nepoškozenou hematoencefalickou bariérou
jako volný bilirubin.
Postup pro nahlášení kritické
hodnoty výsledku laboratorního vyšetření je uveden ve směrnici S-OKBH-012 Směrnice pro vydávání výsledků.
Řízení kvality
Příprava:
Tekutá
kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě
Před
použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla
pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro
zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny.
Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány
v lednici při +2 až +
Stabilita:
Tekutá
kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě
Použití:
Měření kontrolního materiálu se
provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci, po měření blanku
reagencie, po výměně reagencie. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným
pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004 Směrnice pro IKK
Dokumentace:
Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru
přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS
a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucím
úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány v programu
UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové měsíční zhodnocení
výsledků kontrol vedoucím úseku.
Součástí kontroly a řízení
kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality
organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí
účastní alespoň 2x ročně.
Poznámky
nevyplněno
Jiné související
informace
nevyplněno
Literatura
Appendixy
nevyplněno
Autorské
poznámky
nevyplněno
Recenze,
schválení
Autor: Mgr. Pavlína Babičová