OSN-SAbstraktOSN-E

Kvantitativní fotometrické stanovení triacylglycerolů v lidském séru, plazmě soupravou Roche Cobas TRIGL na analyzátoru Roche Cobas 6000, modul c501.

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentů a textůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

S-OKBH-005 Směrnice EHK

S-OKBH-019 Verifikace postupů měření

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Příbalový leták Roche Cobas TRIGL pro kvantitativní stanovení TAG, kat.č. REF20767107322

Příbalový leták pro Systémový kalibrátor Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190

Příbalový leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti Biorad,LiquichekTM

 

 

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

TAG, Triglyceridy, Triacylglyceroly

Reagenční souprava: ROCHE TRIGL, kat.č. REF20767107322

Název v lokálním číselníku LIS: Triacylglyceroly

Klíč v lokálním číselníku LIS: TAG

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 34

Kód metody v analyzátoru: 781

Název metody v analyzátoru: TAG

Seznam zdravotních výkonů VZP: 81611 Stanovení triacylglycerolů

 

OSN-SPrincipOSN-E

Stanovení je založeno na sérii sdružených enzymatických reakcí:

V první fázi se triacylglyceroly ze vzorku hydrolyzují za katalytického působení kombinace mikrobiálních lipoproteinových lipáz (LPL) za vzniku glycerolu a mastných kyselin:

 

Triacylglyceroly  + 3 H2O  ------------ LPL  ------------------  glycerol  +  3 mastné kyseliny

 

Uvolněný glycerol je fosforylován adenosintrifosfátem za působení glycerolkinázy (GK) a Mg2+ iontů.  Vzniká glycerol-3-fosfát:

 

Glycerol  +  ATP ---------------- GK (Mg2+)  ---------------------   glycerol-3-fosfát +  ADP

 

Glycerol-3-fosfát se katalyticky oxiduje molekulárním kyslíkem za působení enzymu glycerolfosfátoxidázy (GPO) na dihydroxyacetonfosfát a peroxid vodíku:

 

Glycerol-3-fosfát  +  O2  ----------------- GPO --------------------   dihydroxyacetonfosfát  +  H2O2

 

Vzniklý peroxid vodíku  reaguje s 4-aminofenazonem a 4-chlorofenolem za katalýzy peroxidázy (Trinderova reakce). Produktem reakce je barvivo, jehož absorbance je vhodná k fotometrickému měření při 505/700 nm:

 

2H2O2  +  4-aminoantipyrin  +  4-chlorofenol ----- peroxidáza ---- barevný produkt  + 2H2O + HCl

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

 

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

 

OSN-SFáze před vyšetřením

Stanovení triacylglycerolů patří mezi základní biochemické stanovení v lipidovém metabolismu.

Triacylglyceroly se řadí do skupiny lipidů. Chemickým složením se jedná o estery trojsytného alkoholu glycerolu a vyšších mastných kyselin. Třemi nejdůležitějšími mastnými kyselinami jsou nasycené kyseliny stearová (C15) a palmitová (C17) a nenasycená kyselina olejová (C18).

Přírodní tuky jsou směsí různých triacylglycerolů. Přestože se jedná o směs látek, vyjadřuje se koncentrace triacylglycerolů v mmol/l.

Triacylglyceroly jsou v krvi výlučně vázané na lipoproteiny (exogenní z potravy převládají v chylomikronech, endogenní v částicích VLDL.

Triacylglyceroly jsou hlavní formou uchovávání energie v organismu, protože při spalování (oxidují se kompletně až na oxid uhličitý a vodu) poskytují až dvojnásobné množství energie na hmotnostní jednotku, než cukry nebo bílkoviny.

Zvýšená koncentrace triacylglycerolů se považuje za rizikový faktor aterosklerózy. Nacházíme ji u lidí s akutní i chronickou pankreatitidou, se špatnou dietou, aterosklerózou, kardiovaskulárními chorobami, u mnoha typů hyperlipoproteinemií, u nefrotického syndromu, u diabetes mellitus, u hypertyreozy a u jaterních onemocnění (extrahepatální biliární obstrukce). Využívá se i při klasifikaci různých genetických a lipoproteinových poruchOSN-E

 

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.

Plazma: Li-heparin, K3EDTA

Při odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr vzorku.

 

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až + 8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedeném v  LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce.

Interference sérum/plazma

Stanovení ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 434 µmol/l

Stanovení ovlivňuje koncentrace konjugovaného bilirubinu, je- li >171 µmol/l a je-li koncentrace nekonjugovaného bilirubinu >599 µmol/

Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle příbalového letáku

+20 až +25°C: 2 dny, +2 až +8°C: 10 dnů,3 měsíce při -20 0C

 

OSN-SOmezeníOSN-E

Nepoužívat zkumavky se zátkami potaženými glycerolem.  

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků.

 

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti 2000 g (rcf) Resp. 3333 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány. 

 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Biochemický analyzátor ROCHE cobas 6000

 

Reagencie

Souprava: Roche Cobas TRIGL, katalogové číslo 207667107 (250 testů)

Diluent  NaCL 9%

Výrobce soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim

Dodavatel soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4, 150 00 Praha - 5

 

 

reagencie

pracovní roztok

R1

PIPES pufr: 50 mmol/l pH 6,8

Mg2+: 40 mmol/l

Cholát sodný: 0,20 mmol/l

ATP:³ 1,4 mmol/l

4-aminofenazon:³ 0,13 mmol/l

4-chlorofenol: 4,7 mmol/l

Lipoproteinlipáza (Pseudomonas spec.):³ 83 mkat/l

Glycerokináza (Bacillus stearothermophilus): ³ 3 mkat/l

Glycerolfosfát oxidáza (E.coli): ³ 41 mkat/l

Křenová peroxidáza: ³ 1,6 mkat/l

konzervans

 

OSN-S

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici při teplotě +2 až + 8 °C

Stabilita: Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až + 8 °C.

Stabilita v analyzátoru: 8 týdnů, Diluent NaCl 9% 12 týdnů

Manipulace s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do analyzátoru bez úprav.

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

 

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Odběrové nádobky

Špičky k automatickým pipetám

 

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu STAND BY dle návodu v manuálu analyzátoru  PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

OSN-SPracovní postupOSN-E

Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy: 2,0 µl    

 

Přesný popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru  PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

Záznamy o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.

 

Denně, před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních sérových materiálech na hladině 1 a 2.  S-OKBH-004 Směrnice pro IKK.

 

V případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.

Vyhovuje-li naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků na posuvný pás Roche cobas 6000.Pokud je biologického materiálu málo přepipetuje se do hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.

Pokud je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá automaticky.

Požadavky na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí klávesnice řídícího počítače analyzátoru.

Výsledky se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí 

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

 

1. Vloží se reagenční souprava.

2. V případě potřeby se provede kalibrace.

3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku, který se umístí na posuvný pás

4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY, stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.

5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.

 

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Přesný popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru  PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

 

Ke kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor C.f.a.s., kat.č. 10759350190, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou hodnotou pro TAG.

 

Návaznost:

Metoda je standardizována podle metody ID/MS

 

Příprava kalibrátoru:

Kalibrátor je dodáván v lyofilizovaném stavu.

 

Doporučený postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:

1.Opatrně otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost zabránění   ztrátám lyofilizovaného materiálu zachyceného na gumové vložce.

2.Přidat do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione Braun.

3.Uzavřít gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do kompletního rozpuštění obsahu.

 

Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až + 8°C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený v lednici při +2 až + 8 °C. Alikvoty kalibrátoru se uchovávají v mrazáku při teplotě -20 °C po dobu max.30dní.

 

Vlastní kalibrace:

Kalibrace je 2-bodová, lineární a provádí se pomocí sérové matrice v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový bod je deionizovaná voda tzv. reagenční blank.

Bezprostředně po provedení kalibrace se musí provést kontrola kvality.

 

Frekvence kalibrace:

Provádí se při změně šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie v přístroji.

OSN-S

Způsob dokumentace kalibračních dat:

Provedené kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací Roche cobas c501

 

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristiky spolehlivosti z příbalového letáku

 

Rozsah měření v séru, plazmě:

Při stanovení TAG v séru, plazmě je oblast linearity 0,10 – 10,0 mmol/l

 

Opakovatelnost (přesnost v sérii):

Opakovatelnost (n=21)

Průměr [mmol/l]

SD [mmol/l]

CV [%]

Precinorm U

1,41

0,01

0,9

Precipath U

2,40

0,02

0,8

Lidské sérum 1

1,67

0,02

1,1

Lidské sérum 2

2,72

0,02

0,7

 

Mezilehlá preciznost (mezi sériemi):

Mezilehlá přesnost

Průměr [mmol/l]

SD [mmol/l ]

CV [%]

Precinorm U

1,39

0,03

2,0

Precipath U

2,33

0,04

1,6

Lidské sérum 3

1,18

0,02

1,9

Lidské sérum 4

2,95

0,05

1,8

 

Mez detekce:                      0,10 mmol/l

Mez stanovitelnosti:          výrobce neuvádí, odvozena z meze detekce 0,3 mmol/l

 

Korelace s jinou metodou: Hodnoty TAG získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917

 

Typ vzorku

Počet vzorků

Rovnice

Passing/Bablok

Korelační koeficient

Rozmezí vzorku

Sérum,

plazma

71

Y=1,015x- 0,005

0,976

0,560– 9,13 mmol/l

 

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu TAG v séru, plazmě pro analyzátor ROCHE cobas 6000/ c 501.

 

OSN-SDokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Hodnoty výsledků stanovení TAG v séru, plazmě se udávají na dvě desetinná místa, v mmol/l.

Poznámka: Přepočet starších jednotek používaných dříve pro TAG: mg/dl x 0,0113 = mmol/l.

 

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha

 

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

 

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

 

 Výsledkový list obsahuje:

·         identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

·         odkaz na akreditaci laboratoře

·         datum a čas vydání nálezu

·         jednoznačnou identifikaci pacienta

·         zdravotní pojišťovnu pacienta

·         identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

·         identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

·         diagnózu pacienta

·         druh biologického materiálu (např. sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

·         jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

·         datum a čas přijetí vzorku laboratoří

·         datum a čas odběru vzorku,

·         výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

·         označení akreditované metody

·         referenční meze

·         interpretaci výsledků, je-li to nutné

·         jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

·         identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

·         zkratky identifikující žádanku

př. 20.BR-0777

·         20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

·         př. 20.HH-0777

·         20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

 

OSN-SReferenční a varovná rozmezíOSN-E

Referenční a varovná rozmezí

Při klinickém hodnocení hladin triacylglycerolů se místo referenčních rozmezí využívají Cut-Off hodnoty, založené na studiích úmrtnosti na aterosklerózu, vycházející z doporučení NCEP (National cholesterol education program) z USA, které pro použití v českém prostředí přizpůsobilo doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnotících mezí krevních lipidů a lipoproteinů pro dospělou populaci (Klinická biochemie a metabolismus 1/2010, www.cskb.cz / doporučení)

Cut Off                 Sérum, plazma:  dospělí  : 0,45 – 1,70 mmol/l

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Ke zvýšení koncentrace triacylglycerolů dochází u celé řady syndromů a onemocnění, například:

-          při nefropatiích a thyreopatiích se prokazuje hypertriacylglycerolémie

-          při hyperurikemickém syndromu k vyloučení sekundárních poruch lipidového metabolismu
 (např. alkoholismus, cholestáza, dna, některé paraproteiny, těžké infarkty myokardu)

-          při pankreatitidách

-          při diabetes mellitus

-          vždy, když je zakalené sérum při odběru nalačno

-          u jaterních onemocnění

-          u hypotyreosy

 

Snížená koncentrace TAG nemá klinický význam.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

 

Ke kontrole a řízení kvality pro stanovení TAG v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy Biorad Liquid Assayed Multiqual se sérovou  matricí ve třech rozmezích koncentrace pro TAG měřené na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000/c501.

 

Příprava:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C.

Před použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny. Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány v lednici při +2 až +8 °C. Před použitím se opatrně alikvot promíchá pro zajištění homogenity vzorku kontroly.

 

Stabilita:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C, v tom případě jsou stabilní až do doby exspirace vyznačené na obale. Připravené alikvoty kontroly se uchovává v v lednici při +2 až +8 °C do spotřebování, nejdéle 1 týden.

 

Použití:

Měření kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci, po měření blanku reagencie, při výměně setu stejné šarže. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

 

Dokumentace:

Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku. 

 

Součástí kontroly a řízení kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí účastní alespoň 2x ročně.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

 nevyplněno

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

 

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Pavlína Babičová