Kvantitativní
fotometrické stanovení triacylglycerolů v lidském séru, plazmě
soupravou Roche Cobas TRIGL na analyzátoru Roche Cobas 6000, modul c501.
Seznam souvisejících
dokumentů a textů
Laboratorní
příručka
Příručka
kvality
Provozní řád
S-OKBH-005
Směrnice EHK
S-OKBH-019
Verifikace postupů měření
PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000
Příbalový leták Roche Cobas TRIGL pro
kvantitativní stanovení TAG, kat.č. REF20767107322
Příbalový leták pro Systémový kalibrátor
Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190
Příbalový
leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti
Biorad,LiquichekTM
Kódy a názvy v různých
klasifikačních systémech
TAG,
Triglyceridy, Triacylglyceroly
Reagenční souprava: ROCHE TRIGL,
kat.č. REF20767107322
Název v lokálním číselníku LIS:
Triacylglyceroly
Klíč
v lokálním číselníku LIS: TAG
Číslo
metody v lokálním číselníku LIS: 34
Kód metody v analyzátoru: 781
Název metody v analyzátoru: TAG
Seznam
zdravotních výkonů VZP: 81611 Stanovení triacylglycerolů
Princip
Stanovení
je založeno na sérii sdružených enzymatických reakcí:
V první
fázi se triacylglyceroly ze vzorku hydrolyzují za katalytického působení
kombinace mikrobiálních lipoproteinových lipáz (LPL) za vzniku glycerolu a
mastných kyselin:
Triacylglyceroly +
3 H2O ------------ LPL ------------------ glycerol
+ 3 mastné kyseliny
Uvolněný
glycerol je fosforylován adenosintrifosfátem za působení glycerolkinázy (GK) a
Mg2+ iontů. Vzniká glycerol-3-fosfát:
Glycerol
+ ATP ---------------- GK (Mg2+) ---------------------
glycerol-3-fosfát + ADP
Glycerol-3-fosfát
se katalyticky oxiduje molekulárním kyslíkem za působení enzymu
glycerolfosfátoxidázy (GPO) na dihydroxyacetonfosfát a peroxid vodíku:
Glycerol-3-fosfát
+ O2 ----------------- GPO --------------------
dihydroxyacetonfosfát + H2O2
Vzniklý
peroxid vodíku reaguje s 4-aminofenazonem a 4-chlorofenolem za katalýzy peroxidázy
(Trinderova reakce). Produktem reakce je barvivo, jehož absorbance je vhodná
k fotometrickému měření při 505/700 nm:
2H2O2
+ 4-aminoantipyrin + 4-chlorofenol ----- peroxidáza ----
barevný produkt + 2H2O
+ HCl
Místo provádění postupu
OKBH, úsek biochemický, Nemocnice
AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84
Ostrava-Vítkovice
Bezpečnostní aspekty
Je
nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02,
ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem
přenosu některých infekcí. Zejména je třeba
zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní
prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po
práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou
a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí
vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a
kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím,
pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem.
Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a
vyhledat lékařskou pomoc.
Fáze před vyšetřením
Stanovení
triacylglycerolů patří mezi základní biochemické stanovení v lipidovém
metabolismu.
Triacylglyceroly
se řadí do skupiny lipidů. Chemickým složením se jedná o estery trojsytného
alkoholu glycerolu a vyšších mastných kyselin. Třemi nejdůležitějšími mastnými
kyselinami jsou nasycené kyseliny stearová (C15) a palmitová (C17) a nenasycená
kyselina olejová (C18).
Přírodní
tuky jsou směsí různých triacylglycerolů. Přestože se jedná o směs látek,
vyjadřuje se koncentrace triacylglycerolů v mmol/l.
Triacylglyceroly
jsou v krvi výlučně vázané na lipoproteiny (exogenní z potravy
převládají v chylomikronech, endogenní v částicích VLDL.
Triacylglyceroly
jsou hlavní formou uchovávání energie v organismu, protože při spalování
(oxidují se kompletně až na oxid uhličitý a vodu) poskytují až dvojnásobné
množství energie na hmotnostní jednotku, než cukry nebo bílkoviny.
Zvýšená
koncentrace triacylglycerolů se považuje za rizikový faktor aterosklerózy.
Nacházíme ji u lidí s akutní i chronickou pankreatitidou, se špatnou
dietou, aterosklerózou, kardiovaskulárními chorobami, u mnoha typů
hyperlipoproteinemií, u nefrotického syndromu, u diabetes mellitus, u
hypertyreozy a u jaterních onemocnění (extrahepatální biliární obstrukce).
Využívá se i při klasifikaci různých genetických a lipoproteinových poruch
Odběr primárního vzorku a
transport
Odběr
Sérum: Odběr
se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky
s aktivátorem srážení nebo se separačním
gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani
dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.
Plazma:
Li-heparin, K3EDTA
Při odběru primárního vzorku se postupuje
podle pracovní instrukce PI-OKBH-19
Odběr vzorku.
Transport
Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je
popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro
transport a příjem vzorků.
Skladování
Sérum/plazma
je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až +
V případě
delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno
zamraženo při teplotě
Interference
sérum/plazma
Stanovení
ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 434 µmol/l
Stanovení
ovlivňuje koncentrace konjugovaného bilirubinu, je- li >171 µmol/l a je-li
koncentrace nekonjugovaného bilirubinu >599 µmol/
Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle
příbalového letáku
+20
až +25°C: 2 dny, +2 až +8°C: 10 dnů,3 měsíce při -20
Omezení
Nepoužívat
zkumavky se zátkami potaženými glycerolem.
Laboratoř
může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření
z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole
kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků.
Manipulace se vzorky
Manipulace
se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem
uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.
Primární
zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti
2000 g (rcf) Resp. 3333 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze.
Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány.
Přístroje a pomůcky
Centrifuga
Biochemický
analyzátor ROCHE cobas 6000
Reagencie
Souprava: Roche Cobas TRIGL,
katalogové číslo 207667107 (250 testů)
Diluent
NaCL 9%
Výrobce
soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse
116, D-68305 Mannheim
Dodavatel soupravy:
Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4, 150 00 Praha - 5
reagencie |
pracovní
roztok |
R1 |
PIPES
pufr: 50 mmol/l pH 6,8 Mg2+: 40
mmol/l Cholát
sodný: 0,20 mmol/l ATP:³ 1,4 mmol/l 4-aminofenazon:³ 0,13 mmol/l 4-chlorofenol:
4,7 mmol/l Lipoproteinlipáza
(Pseudomonas spec.):³ 83 mkat/l Glycerokináza
(Bacillus stearothermophilus): ³ 3 mkat/l Glycerolfosfát
oxidáza (E.coli): ³ 41 mkat/l Křenová
peroxidáza: ³ 1,6 mkat/l konzervans |
Skladování:
Reagencie jsou skladovány v lednici při
teplotě +2 až +
Stabilita:
Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až +
Stabilita
v analyzátoru: 8 týdnů, Diluent NaCl 9% 12 týdnů
Manipulace
s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do
analyzátoru bez úprav.
Ověřování kvality: Provádí
se denně pomocí interní kontroly kvality.
Spotřební materiál
Odběrové nádobky
Špičky k automatickým pipetám
Příprava k činnosti
Přístroj
se uvede do stavu STAND BY dle návodu v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000
Pracovní
postup
Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy:
2,0 µl
Přesný
popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Záznamy
o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.
Denně,
před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních
sérových materiálech na hladině
V
případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému
tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést
nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.
Vyhovuje-li
naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit
k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou
kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých
stojánků na posuvný pás Roche cobas 6000.Pokud je biologického materiálu málo
přepipetuje se do hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky
označené čárovým kódem.
Pokud
je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní
obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá
automaticky.
Požadavky
na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím
laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí
klávesnice řídícího počítače analyzátoru.
Výsledky
se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které
provádí pověřený pracovník.
Obsluha
analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře
a pracovní instrukcí
PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Stručný popis postupu
1. Vloží se reagenční souprava.
2. V případě potřeby se provede kalibrace.
3. Vloží se analyzované vzorky do šedého
stojánku, který se umístí na posuvný pás
4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY,
stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.
5. Výsledky testů jsou průběžně
z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.
Kalibrace
a návaznost
Přesný
popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000
Ke
kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor C.f.a.s., kat.č.
10759350190, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a
příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou
hodnotou pro TAG.
Návaznost:
Metoda je standardizována podle metody ID/MS
Příprava kalibrátoru:
Kalibrátor
je dodáván v lyofilizovaném stavu.
Doporučený
postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:
1.Opatrně
otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost
zabránění ztrátám lyofilizovaného
materiálu zachyceného na gumové vložce.
2.Přidat
do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione Braun.
3.Uzavřít
gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do
kompletního rozpuštění obsahu.
Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je
stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až
+ 8°C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený
v lednici při +2 až +
Vlastní kalibrace:
Kalibrace
je 2-bodová, lineární a provádí se pomocí sérové matrice v odpovídajícím
černém kalibračním stojánku, nulový bod je deionizovaná voda tzv. reagenční
blank.
Bezprostředně po provedení kalibrace se musí
provést kontrola kvality.
Frekvence kalibrace:
Provádí
se při změně šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti
s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie
v přístroji.
Způsob dokumentace kalibračních dat:
Provedené
kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace
jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací Roche cobas c501
Charakteristika
spolehlivosti
Charakteristiky
spolehlivosti z příbalového letáku
Rozsah měření v séru, plazmě:
Při
stanovení TAG v séru, plazmě je oblast linearity 0,10 – 10,0 mmol/l
Opakovatelnost (přesnost
v sérii):
Opakovatelnost
(n=21) |
Průměr
[mmol/l] |
SD [mmol/l] |
CV [%] |
Precinorm U |
1,41 |
0,01 |
0,9 |
Precipath U |
2,40 |
0,02 |
0,8 |
Lidské sérum 1 |
1,67 |
0,02 |
1,1 |
Lidské sérum 2 |
2,72 |
0,02 |
0,7 |
Mezilehlá
preciznost (mezi sériemi):
Mezilehlá
přesnost |
Průměr
[mmol/l] |
SD [mmol/l ] |
CV [%] |
Precinorm U |
1,39 |
0,03 |
2,0 |
Precipath U |
2,33 |
0,04 |
1,6 |
Lidské sérum 3 |
1,18 |
0,02 |
1,9 |
Lidské sérum 4 |
2,95 |
0,05 |
1,8 |
Mez
detekce: 0,10
mmol/l
Mez stanovitelnosti: výrobce neuvádí, odvozena z meze
detekce 0,3 mmol/l
Korelace s jinou metodou: Hodnoty
TAG získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami
stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917
Typ
vzorku |
Počet
vzorků |
Rovnice Passing/Bablok |
Korelační
koeficient |
Rozmezí
vzorku |
Sérum, plazma |
71 |
Y=1,015x-
0,005 |
0,976 |
0,560–
9,13 mmol/l |
Aktuální charakteristiky
spolehlivosti:
Aktuální
charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním
protokolu TAG v séru, plazmě pro analyzátor ROCHE cobas 6000/ c 501.
Dokumentace, zpracování dat
a vydávání výsledků
Hodnoty
výsledků stanovení TAG v séru, plazmě se udávají na dvě desetinná místa,
v mmol/l.
Poznámka:
Přepočet starších jednotek používaných dříve pro TAG: mg/dl x 0,0113 = mmol/l.
Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru
analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na
externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v
laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha
Lékařům
na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky
vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě
potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.
Spolupracujícím
lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den
doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.
Výsledkový list obsahuje:
·
identifikaci
laboratoře, která výsledek vydala
·
odkaz na akreditaci laboratoře
·
datum
a čas vydání nálezu
·
jednoznačnou
identifikaci pacienta
·
zdravotní pojišťovnu pacienta
·
identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci
pacienta, je-li to vhodné)
·
identifikaci požadujícího lékaře (resp.
oddělení)
·
diagnózu pacienta
·
druh biologického materiálu (např. sérum,
plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)
·
jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření
·
datum a čas přijetí vzorku laboratoří
·
datum a čas odběru vzorku,
·
výsledek vyšetření s odpovídajícími
jednotkami (nejčastěji SI jednotky)
·
označení akreditované metody
·
referenční meze
·
interpretaci
výsledků, je-li to nutné
·
jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost
primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek
požadovaného vyšetření)
·
identifikaci osob, které výsledkovou zprávu
kontrolovaly a schválily
·
zkratky identifikující žádanku
př. 20.BR-0777
·
20: den v měsíci, BR: biochemie rutina,
0777: číslo vzorku
·
př. 20.HH-0777
·
20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777:
číslo vzorku
Referenční a varovná rozmezí
Referenční a varovná rozmezí
Při
klinickém hodnocení hladin triacylglycerolů se místo referenčních rozmezí
využívají Cut-Off hodnoty, založené na studiích úmrtnosti na aterosklerózu,
vycházející z doporučení NCEP (National cholesterol education program)
z USA, které pro použití v českém prostředí přizpůsobilo doporučení
České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro
aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnotících mezí krevních lipidů a
lipoproteinů pro dospělou populaci (Klinická biochemie a metabolismus 1/2010, www.cskb.cz
/ doporučení)
Cut Off Sérum,
plazma: dospělí : 0,45 – 1,70 mmol/l
Interpretace výsledků,
konzultační činnosti a hlášení
Ke
zvýšení koncentrace triacylglycerolů dochází u celé řady syndromů a onemocnění,
například:
-
při nefropatiích a thyreopatiích se prokazuje hypertriacylglycerolémie
-
při hyperurikemickém syndromu k vyloučení sekundárních poruch
lipidového metabolismu
(např. alkoholismus, cholestáza, dna, některé paraproteiny, těžké
infarkty myokardu)
-
při pankreatitidách
-
při diabetes mellitus
-
vždy, když je zakalené sérum při odběru nalačno
-
u jaterních onemocnění
-
u hypotyreosy
Snížená koncentrace TAG nemá
klinický význam.
Řízení kvality
Ke kontrole a řízení kvality pro stanovení
TAG v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy Biorad
Liquid Assayed Multiqual se sérovou matricí ve třech rozmezích koncentrace
pro TAG měřené na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000/c501.
Příprava:
Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená
při teplotě
Před použitím se nechá kontrola za
laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla pozvolna rozpustit
za občasného promíchání kroužením lahvičky pro zajištění homogenity
materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny. Z rozmraženého
materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány v lednici při +2 až +
Stabilita:
Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená
při teplotě
Použití:
Měření
kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci,
po měření blanku reagencie, při výměně setu stejné šarže. Výsledky jsou
kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004
Směrnice pro IKK
Dokumentace:
Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány
v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny
do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž
validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány
v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové
měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku.
Součástí
kontroly a řízení kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách
kvality organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř
se jí účastní alespoň 2x ročně.
Poznámky
nevyplněno
Jiné související informace
nevyplněno
Literatura
Appendixy
nevyplněno
Autorské poznámky
nevyplněno
Recenze, schválení
Autor:
Mgr. Pavlína Babičová