OSN-SAAAAAbstrakt

Kvantitativní fotometrické stanovení celkového cholesterolu v lidském séru, v plazmě enzymatickým testem soupravou Roche CHOL2, na analyzátoru Cobas 6000, modul c501.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentů a textůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

S-OKBH-005 Směrnice EHK

S-OKBH-019 Verifikace postupů měření

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Příbalový leták Roche Cobas CHOL2 pro kvantitativní stanovení CHOL, kat.č. REF03039773190

Příbalový leták pro Systémový kalibrátor Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190

Příbalový leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti Biorad,Liquichek^TM

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

CHOL, cholesterol, CHOL celk., celkový cholesterol

Reagenční souprava: ROCHE CHOL2, kat.č. REF03039773190

Název v lokálním číselníku LIS: Cholesterol

Klíč v lokálním číselníku LIS: CHOL

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 33

Kód metody v analyzátoru: 798

Název metody v analyzátoru: CHOL

Seznam zdravotních výkonů VZP: 81471 Cholesterol

OSN-SPrincipOSN-E

Stanovení je založeno na sérii sdružených enzymatických reakcí:

Estery cholesterolu jsou hydrolyzovány cholesterol esterázou na cholesterol a volné mastné kyseliny.

estery cholesterolu + H₂O ---------------- ^{cholesterolesteráza}---------------------cholesterol + MK

cholesterol se katalyticky oxiduje molekulárním kyslíkem na cholest-4-en-3-on a peroxid vodíku:

cholesterol + 2O₂ ----------------- ^{cholesteroloxidasa}------------- cholest-4-en-3-on + 2H₂O₂

Vzniklý peroxid vodíku reaguje s 4-aminoantipyrinem a s fenolem za katalýzy peroxidázy (Trinderova reakce). Produktem reakce je barevný produkt, jehož absorbance je vhodná k fotometrickému měření při 505/700nm:

2H₂O₂ + 4-aminoantipyrin + fenol ----- ^peroxidáza----barevný produkt (chinonimin) + 4 H₂O

Intenzita vytvářeného zabarvení je přímo úměrná koncentraci cholesterolu.

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřením (příprava pacienta)OSN-E

Stanovení celkového cholesterolu patří mezi základní biochemické stanovení v lipidovém metabolismu.

Cholesterol a jeho estery se obvykle řadí do heterogenní skupiny "lipidů" nebo "lipoidních látek" v krvi.

Cholesterol (sumární vzorec C₂₇H₄₆O, molekulová hmotnost 386,64) patří mezi steroly, což jsou 3‑hydroxyderiváty cholestanu.

V lidském organismu se vyskytuje buď jako volný nebo jako esterifikovaný (asi 2/3 z celkového množství cholesterolu) na hydroxylové skupině v poloze 3 vyššími mastnými kyselinami.

Organismus získává cholesterol budˇ z potravy (asi 1/4 celkového cholesterolu v těle) nebo vlastní biosyntézou. Syntéza cholesterolu z acetyl-CoA probíhá téměř ve všech tkáních, ale nejvíce (asi 90 % z celkové produkce) vzniká v játrech. Denní produkce se udává kolem 1,2 g. Sérový cholesterol představuje jen asi 7 % celkového množství cholesterolu v organismu. Koncentrace cholesterolu v krvi je zčásti ovlivněna genetickými faktory a z části množstvím tuku přijatého potravou.

Odbourávání cholesterolu v lidském organismu nenastává, vylučuje se proto z organismu žlučí buď v nezměněné formě, nebo po přeměně na žlučové kyseliny. Cholesterol představuje významný substrát pro vznik steroidů (nadledvinkových a pohlavních hormonů, jako jsou například kortisol, aldosteron, testosteron, estradiol, estriol) a pro vitaminy skupiny D (kalcitriol). Cholesterol je součástí membrán všech tělních buněk. Biologický poločas cholesterolu je 58 - 101 dní.

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná,ale pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno nalačno.

Plazma: Li-heparin, K3-EDTA

Při odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr vzorku.

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až + 8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedeném v LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce.

Interference sérum/plazma

Stanovení ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 435 µmol/l

Stanovení ovlivňuje koncentrace konjugovaného bilirubinu je- li >274 µmol/l a je-li koncentrace nekonjugovaného bilirubinu >239 µmol/l

Stanovení ovlivňuje lipémie je-li index L > 2000

Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle příbalového letáku

+15 až +25°C: 7 dní, +2 až +8°C: 7 dnů,3 měsíce při -20 ⁰C

OSN-SOmezeníOSN-E

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků.

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti 2000 g (rcf) Resp. 3333 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány.

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Analyzátor ROCHE Cobas 6000, modul c501

OSN-SReagencieOSN-E

Souprava CHOL2 (pro 400 testů), katalogové číslo 03039773190

Výrobce soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim

Dodavatel soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4 , 150 00 Praha - 5

reagencie

Pracovní roztok

PIPES pufr: 225 mmol/l, pH 6,8

Mg2+: 10 mmol/l

Cholát sodný: 0,6 mmol/l

4-aminofenazon:³ 0,45 mmol/l

fenol:³ 12,6 mmol/l

mastný alkohol polyglykoléter: 3%ní

Cholesterol esteráza (Pseudomonas spec.): ³ 25 mkat/l

Cholesterol oxidáza (E.coli): ³ 7,5 mkat/l

Křenová peroxidáza: ³ 12,5 mkat/l

Stabilizátory konzervans

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici při teplotě +2 až + 8 °C

Stabilita: Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až + 8 °C.

Stabilita v analyzátoru: 4 týdny, Diluent NaCl 9 % 12 týdnů

Manipulace s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do analyzátoru bez úprav.

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

OSN-S

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Odběrové nádobky

Špičky k automatickým pipetám

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu STAND BY dle návodu v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

OSN-SPracovní postupOSN-E

Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy: 2,0 µl

Přesný popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

Záznamy o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.

Denně, před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních sérových materiálech ve dvou hladinách. S-OKBH-004 Směrnice pro IKK.

V případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.

Vyhovuje-li naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků na posuvný pás Roche cobas c501.Pokud je biologického materiálu málo přepipetuje se do Hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.

Pokud je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá automaticky.

Požadavky na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí klávesnice řídícího počítače analyzátoru.

Výsledky se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

1. Vloží se reagenční souprava.

2. V případě potřeby se provede kalibrace.

3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku, který se umístí na posuvný pás

4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY, stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.

5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Přesný popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

Ke kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor C.f.a.s., kat.č. 10759350, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou hodnotou pro CHOLESTEROL.

Návaznost:

Metoda je standardizována dle Abell-Kendalla a také podle metody izotopové ředění/hmotnostní spektrometrie

Příprava kalibrátoru:

Kalibrátor je dodáván v lyofilizovaném stavu.

Doporučený postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:

1.Opatrně otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost zabránění ztrátám lyofilizovaného materiálu zachyceného na gumové vložce.

2.Přidat do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione Braun.

3.Uzavřít gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do kompletního rozpuštění obsahu.

Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až + 8°C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený v lednici při +2 až + 8 °C. Alikvoty kalibrátoru se uchovávají v mrazáku při teplotě -20 °C po dobu max.30dní.

Vlastní kalibrace:

Kalibrace je 2-bodová, lineární a provádí se pomocí sérové matrice v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový bod je deionizovaná voda tzv. reagenční blank.

Bezprostředně po provedení kalibrace se musí provést kontrola kvality.

Kalibrace se provádí vždy při založení nové šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie v přístroji.

Způsob dokumentace kalibračních dat: Provedené kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace Kalibrace cobas c501.

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristiky spolehlivosti z příbalového letáku

Rozsah měření v séru, plazmě:

Při stanovení cholesterolu v séru, plazmě je oblast linearity 0,1– 20,7 mmol/l.

Opakovatelnost (přesnost v sérii):

Sérum, plazma:

Opakovatelnost (n=21)	Průměr [mmol/l]	SD [mmol/l]	CV [%]
Precinorm U	2,29	0,02	1,1
Precipath U	4,74	0,04	0,9
Lidské sérum 1	2,85	0,03	1,1
Lidské sérum 2	7,39	0,05	0,7

Mezilehlá preciznost (mezi sériemi):

Mezilehlá preciznost	Průměr [mmol/l]	SD [mmol/l ]	CV [%]
Precinorm U	2,31	0,04	1,6
Precipath U	4,85	0,08	1,6
Lidské sérum 3	1,97	0,03	1,6
Lidské sérum 4	7,13	0,10	1,4

Mez detekce: 0,1 mmol/l

Mez stanovitelnosti: výrobce neuvádí,odvozena z meze detekce 0,3 mmol/ l

Korelace s jinou metodou: Hodnoty Cholesterolu získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917

Typ vzorku

Počet vzorků

Rovnice

Passing/Bablok

Korelační koeficient

Rozmezí vzorku

sérum

266

Y=1,002x- 0,045

0,953

1,53 – 18,5 mmol/l

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu Cholesterolu v séru, plazmě pro analyzátor cobas c 501.

OSN-SDokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Hodnoty výsledků stanovení CHOL v séru, plazmě se udávají na dvě desetinná místa, v mmol/l.

Poznámka: Přepočet starších jednotek používaných pro CHOL: mg/dl x 0,0259 = mmol/l.

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

Výsledkový list obsahuje:

· identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

· odkaz na akreditaci laboratoře

· datum a čas vydání nálezu

· jednoznačnou identifikaci pacienta

· zdravotní pojišťovnu pacienta

· identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

· identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

· diagnózu pacienta

· druh biologického materiálu (např. sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

· jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

· datum a čas přijetí vzorku laboratoří

· datum a čas odběru vzorku,

· výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

· označení akreditované metody

· referenční meze

· interpretaci výsledků, je-li to nutné

· jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

· identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

· zkratky identifikující žádanku

př. 20.BR-0777

· 20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

· př. 20.HH-0777

· 20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

OSN-SReferenční a varovná rozmezíOSN-E

Cut Off Dospělí: sérum, plasma: 2,9 – 5,0 mmol/l dle doporučení ČSKB

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Klinická interpretace dle doporučení European Atherosclerosis Society:

[ mmol/l ]

Poruchy lipid. metabolismu

Cholesterol

Triglyceridy

< 5,18

< 2,26

cholesterol

5,18 – 7,77

ANO

jestliže HDL-cholesterol

je < 0,9 mmol/l

Cholesterol

Triglyceridy

> 7,77

> 2,26

ANO

Zvýšená koncentrace cholesterolu se považuje za jeden z významných rizikových faktorů vzniku aterosklerózy. Stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru, plazmě proto patří k základním metodám při zajišťování prevence a hodnocení rizika vzniku aterosklerózy, ischemické choroby srdeční a infarktu myokardu.

Snížení sérové koncentrace cholesterolu se nachází u řady syndromů:

- lipoproteinémie

- těžká hepatopatie (hepatitidy, cirhóza, toxické poškození jater)

- hladovění

- těžké septické stavy

- terminální stadium urémie

- hypertyreóza

- anemie

- tumorózní kachexie

- aplikace léků ovlivňujících syntézu cholesterolu (například dlouhodobá léčba kortikoidy), aj.

Zvýšené hodnoty sérové koncentrace cholesterolu: se objevují například u syndromů:

- nefropatie

- hepatopatie (obstrukční ikterus)

- pankreatopatie

- diabetes mellitus

- hyperlipoproteinemie

- hypotyreoza

- insuficience hypofýzy

- dna

- a další příčiny

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Ke kontrole a řízení kvality pro stanovení cholesterolu v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy Biorad Liquid Assayed Multiqual se sérovou matricí ve třech rozmezích koncentrace pro cholesterol měřený na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000/c501.

Příprava:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C.

Před použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny. Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány v lednici při +2 až +8 °C. Před použitím se opatrně alikvot promíchá pro zajištění homogenity vzorku kontroly.

Stabilita:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C, v tom případě jsou stabilní až do doby exspirace vyznačené na obale. Připravené alikvoty kontroly se uchovává v v lednici při +2 až +8 °C do spotřebování, nejdéle 1 týden.

Použití:

Měření kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci, po měření blanku reagencie, při výměně setu stejné šarže. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

Dokumentace:

Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku.

Součástí kontroly a řízení kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí účastní alespoň 2x ročně.

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SJiné související informaceOSN-E

nevyplněno

OSN-SLiteraturaOSN-E

Racek, J. et al: Klinická biochemie. Galén, Praha, 2006, ISBN 80-7262-324-9.
Kolektiv autorů: Preanalytická fáze, Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP a SEKK, Pardubice, 2005, ISBN 80-239-5198-X.
Kaplan, L.A, Pesce, A.J.: Clinical Chemistry, Theory, analysis and correlation, V.S.Mosby C., 1989;
Thomas, L.: Clinical Laboratory Diagnostics, Use and Assessment of Clinical Lab. Results, TH-Books 1998;
Burtis, C., A., Ashwood, E., R.: Tietz Textbook of Clinical Biochemistry, 2. vydání, 1994;
Statland B.S.: Clinical Decision Levels for Lab Tests, Medical Economic Books 1987;
Vnitřní materiály, společnosti ROCHE
Doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnotících mezí krevních lipidů a lipoproteinů pro dospělou populaci.(Klinická biochemie a metabolismus 1/2010, www.cskb.cz / doporučení
Rifai, N., a spol.: Lipids, lipopreteins a apolipoproteins IN: Tietz Textbook of Clinical Biochemistry, 3. vydání, 1999
Klinická biochemie a metabolismus 1/2010

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

1. Referenční meze

Při klinickém hodnocení hladin cholesterolu se místo referenčních rozmezí využívají Cut-Off hodnoty, založené na studiích úmrtnosti na aterosklerózu, vycházející z doporučení NCEP (National cholesterol education program) z USA, které pro použití v českém prostředí přizpůsobilo doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP a České společnosti pro aterosklerózu ČLS JEP ke sjednocení hodnotících mezí krevních lipidů a lipoproteinů pro dospělou populaci (Klinická biochemie a metabolismus 1/2010, www.cskb.cz / doporučení)

Cut-Off sérum, plasma: 2,9 – 5,0 mmol/l

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Pavlína Babičová