Stanovení
katalytické aktivity enzymu AST v séru a v plazmě enzymaticky
soupravou Roche Cobas ASTLP (IFCC) na
analyzátoru Cobas 6000, modul c501.
Seznam souvisejících
dokumentů a textů
Laboratorní příručka
Příručka kvality
Provozní řád
S-OKBH-005 Směrnice EHK
S-OKBH-019
Verifikace postupů měření
PI-OKBH-04 Práce s LIPOCLEAR
PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000
Příbalový leták Roche Cobas ASTLP pro
kvantitativní stanovení AST, kat.č. REF04467493190
Příbalový leták pro Systémový kalibrátor
Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190
Příbalový
leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti
Biorad,LiquichekTM
Kódy a názvy v různých
klasifikačních systémech
sérum/plazma
AST, Aspartátaminotransferáza, dříve
GOT
Reagenční
souprava: Roche Cobas ASTLP kat.č. REF04467493190
Název
v lokálním číselníku LIS: AST
Klíč v lokálním číselníku LIS: AST
Číslo
metody v lokálním číselníku LIS: 24
Kód metody v analyzátoru: 686
Název metody v analyzátoru: AST
Seznam
zdravotních výkonů VZP: 81357 AST
81113
AST STATIM
Princip
IFCC metoda.
AST
katalyzuje transaminační reakci L-aspartátu a 2-oxoglutarátu, kdy se tvoří
L-glutamát a oxalacetát:
AST ze vzorku
L-aspartát
+ 2-oxoglutarát L-glutamát
+ oxalacetát
Přídavkem
pyridoxal fosfátu k reakční směsi se zajistí maximální katalytická
aktivita AST.
Oxalacetát
je za katalýzy malátdehydrogenázy (MD) redukovaný na malát a současně se
oxiduje redukovaného nikotinamidadenindinukleotid (NADH) na NAD+:
MD
oxalacetát
+ NADH malát + NAD+
Pokles absorbance NADH se sleduje
fotometricky (kineticky) při 340/410 nm a je úměrný aktivitě enzymu AST ve
vzorku.
Endogenní pyruvát je odstraněn během
inkubační periody účinkem LDH
Místo provádění
postupu
OKBH,
úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava -
Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice
Bezpečnostní
aspekty
Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti
práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým
materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní
hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně),
při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku
především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním
krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut.
Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži
omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným
mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2
litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.
Fáze před vyšetřením
Stanovení
aktivity AST v séru patří mezi základní rutinní metody klinické biochemie
a má celou řadu indikací. Indikací pro vyšetření je především posouzení
onemocnění jater. Pro diagnostiku infarktu myokardu má již stanovení aktivity
AST jen omezený význam vzhledem k malé specificitě.
Výsledek
stanovení AST ovlivňuje fyzická aktivita (zvyšuje o 2-6 %, ale velmi těžká
tělesná námaha až o 75%), věk (2-3x vyšší aktivita u dětí než u dospělých),
pohlaví (muži mají vyšší aktivitu než ženy), těhotenství (mírně snižuje),
požití alkoholu (zvyšuje), poloha při odběru (vleže je aktivita o 10-15%
nižší), denní rytmus (nejvyšší hodnoty bývají mezi
7-11
hodinou, změny během dne až o 15-20%) a aplikace některých léků (penicilin,
salicyláty, opiáty).
AST
se nalézá v myokardu a v kosterním svalu a dále v mozku,
játrech, ledvinách, pankreatu, slezině, plicích, erytrocytech a leukocytech.
Nejvyšší aktivita je v játrech a kosterních svalech. Jsou známé dvě formy
AST: cytoplazmatický izoenzym (412 aminokyselin, Mr = 46116) a
mitochondriální izoenzym
(430
aminokyselin, Mr = 47475). Ke zvýšení aktivity AST v krvi dochází při
zvýšení permeability buněčné membrány, kdy se vyplavuje cytoplazmatický
izoenzym. Při těžším poškození buněk se do krve vyplavuje i mitochondriální
izoenzym.
AST
patří mezi transferázy přenášející dusíkaté skupiny, konkrétně aminoskupinu.
Katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku
oxalacetátu a L-glutamátu. Tato reverzibilní reakce se uplatňuje při syntéze i
odbourávání aminokyselin.
Koenzymem
je pyridoxalfosfát-derivát vitaminu B6 (pyridoxin). V séru není
tento koenzym přítomen vždy v dostatečném množství, proto se přidává
k reakční směsi, čímž může dojít k vzestupu naměřených hodnot až o 20
%.
Odběr primárního vzorku a
transport
Odběr
Sérum: Odběr
se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky
s aktivátorem
srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému.
Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je
vhodný odběr ráno.
Plazma: Li-heparin, EDTA
Při
odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr
vzorku.
Transport
Transport
materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici
S-OKBH-006 Směrnice
pro transport a příjem vzorků.
Skladování
Sérum/plazma je
na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až +
V případě delšího skladování pro potřebu
analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě
Interference sérum/plazma
Stanovení
ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 12,4 µmol/l
Stanovení
ovlivňuje koncentrace konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu, je- li
>1026 µmol/l
Stanovení
ovlivňuje lipémie je-li index L > 150
Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle
příbalového letáku
+20
až +25°C: 4 dny, +2 až +8°C: 7 dnů,3 měsíce při -20
Omezení
Laboratoř může odmítnout
přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů
uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo
odmítnutí primárních vzorků.
Manipulace se vzorky
Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad
práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce
a Příručce kvality.
Primární zkumavka s biologickým
materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti 2000 g (rcf) resp.
3333 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky
obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány.
Přístroje a pomůcky
Centrifuga
Analyzátor ROCHE Cobas 6000, modul c501
Reagencie
Souprava
pro biochemický analyzátor Cobas c 501 ASTLP - 425 testů
Diluent
NaCl 9%
Výrobce
soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse
116, D-68305 Mannheim
Dodavatel soupravy:
Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4, 150 00 Praha - 5
reagencie |
obsah
reagencie |
R1 |
TRIS
pufr: 264 mmol/l pH 7,8 (při + L-aspartát:
792 mmol/l Albumin
(hovězí): 0,25% LDH
(mikroorganismy): ³ 48mkat/l MDH
(mikroorganismy): ³ 24mkat/l konzervans |
R2 |
Pyridoxalfosfát:
730 mmol/l konzervans |
R3 |
2-oxoglutarát:
94 mmol/l NADH
(kvasinky): ³ 1,7 mmol/l konzervans |
Skladování:
Reagencie jsou skladovány v lednici při
teplotě +2 až +
Stabilita:
Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až +
Stabilita
v analyzátoru: 12 týdnů, Diluent NaCl 9% 12 týdnů
Manipulace
s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do
analyzátoru bez úprav.
Ověřování
kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly
kvality.
Spotřební materiál
Odběrové
nádobky
Špičky k automatickým pipetám
Příprava k
činnosti
Přístroj se uvede do stavu Stand By dle
návodu v manuálu analyzátoru, PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.
Silně chylózní vzorky běžně nezpracováváme.
Jestliže lékař stanovení AST požaduje, postupujeme podle návodu pro práci s
LIPOCLEAR PI-OKBH-04 Práce s
LIPOCLEAR.
Pracovní postup
Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy:
9,0 µl
Přesný
popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.
Záznamy
o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.
Denně,
před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních
sérových materiálech na dvou hladinách S-OKBH-004 Směrnice
pro IKK
V
případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému
tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést
nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.
Vyhovuje-li
naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit
k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou
kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků.
Pokud je biologického materiálu málo přepipetuje se do Hitachi kepu, který se
umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.
Pokud
je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní
obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá
automaticky.
Požadavky
na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím
laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí
klávesnice řídícího počítače analyzátoru.
Výsledky
se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které
provádí pověřený pracovník.
Obsluha
analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře
a pracovní instrukcí PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Stručný popis postupu
1. Vloží se reagenční souprava.
2. V případě potřeby se provede kalibrace.
3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku,
který se umístí na posuvný pás
4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY,
stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.
5. Výsledky testů jsou průběžně
z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.
Kalibrace
a návaznost
Přesný
popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál
analyzátoru Cobas c501/6000.
Ke
kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor C.f.a.s., kat.č.
10759350190, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a
příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou
hodnotou pro AST.
Návaznost kalibrátoru:
Metoda je standardizována podle originální
formulace IFCC použitím kalibrovaných pipet spolu s manuálním fotometrem.
Stanovením absolutních hodnot a specifické absorptivity substrátu.
Příprava kalibrátoru:
Kalibrátor
je dodáván v lyofilizovaném stavu.
Doporučený
postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:
1.Opatrně
otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost
zabránění ztrátám lyofilizovaného
materiálu zachyceného na gumové vložce.
2.Přidat
do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione Braun.
3.Uzavřít
gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do
kompletního rozpuštění obsahu.
Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je
stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až
+ 8°C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený
v lednici při +2 až +
Vlastní kalibrace:
Kalibrace
je 2-bodová, lineární RATE a provádí se pomocí sérové matrice
v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový bod je
deionizovaná voda tzv. reagenční blank.
Bezprostředně po provedení kalibrace se musí
provést kontrola kvality.
Frekvence kalibrace:
Provádí
se při změně šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti
s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie
v přístroji.
Způsob dokumentace kalibračních dat: Provedené
kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace
jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací Roche cobas c501
Charakteristika
spolehlivosti
Charakteristika spolehlivosti
z příbalového letáku.
Rozsah měření v séru, plazmě:
Při stanovení AST v séru, plazmě
je oblast linearity 0,08 – 11,7 µkat/l
Opakovatelnost (přesnost
v sérii):
Sérum,
plazma:
Opakovatelnost
(n=21) |
Průměr
[mkat/l] |
SD [mkat/l] |
CV [%] |
Precinorm U |
0,802 |
0,01 |
1,3 |
Precipath U |
2,46 |
0,02 |
0,6 |
Lidské sérum 1 |
2,52 |
0,02 |
0,7 |
Lidské sérum 2 |
0,284 |
0,017 |
6,0 |
Mezilehlá preciznost (mezi
sériemi):
Mezilehlá
preciznost |
Průměr
[mkat/l] |
SD [mkat/l ] |
CV [%] |
Precinorm U |
0,818 |
0,013 |
1,6 |
Precipath U |
2,49 |
0,02 |
0,8 |
Lidské sérum 3 |
0,680 |
0,022 |
3,1 |
Lidské sérum 4 |
3,17 |
0,05 |
1,3 |
Mez
detekce: 0,08
µkat/l
Mez stanovitelnosti: výrobce neuvádí, odvozena z meze
detekce 0,24 µkat/l
Korelace s jinou metodou: Hodnoty
AST získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami
stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917
Typ
vzorku |
Počet
vzorků |
Rovnice Passing/Bablok |
Korelační
koeficient |
Rozmezí
vzorku |
sérum |
177 |
Y=1,00x-
0,0409 |
0,960 |
0,752
– 11,3 µkat/l |
Aktuální
charakteristiky spolehlivosti:
Aktuální
charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním
protokolu AST v séru, plazmě pro analyzátor Roche cobas c 501.
Dokumentace,
zpracování dat a vydávání výsledků
Hodnoty výsledků stanovení AST v séru,
plazmě se udávají na dvě desetinná místa v μkat/l.
Poznámka:
Přepočet jednotek používaných pro AST: U/l x 0,0167 = μkat/l.
Výsledky stanovení jsou uloženy
v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu
archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické
formě v laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha.
Lékařům
na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky
vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě
potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.
Spolupracujícím
lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den
doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.
Výsledkový list obsahuje:
·
identifikaci laboratoře, která výsledek vydala
·
odkaz
na akreditaci laboratoře
·
datum a čas vydání nálezu
·
jednoznačnou identifikaci pacienta
·
zdravotní
pojišťovnu pacienta
·
identifikaci
požadujícího subjektu (lokalizaci
pacienta, je-li to vhodné)
·
identifikaci
požadujícího lékaře (resp. oddělení)
·
diagnózu
pacienta
·
druh
biologického materiálu (např. sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního
obrazu)
·
jasně
srozumitelnou identifikaci vyšetření
·
datum a
čas přijetí vzorku laboratoří
·
datum a
čas odběru vzorku,
·
výsledek
vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)
·
označení
akreditované metody
·
referenční
meze
·
interpretaci výsledků, je-li to nutné
·
jiné poznámky
(např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím
způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)
·
identifikaci
osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily
·
zkratky
identifikující žádanku
př.
20.BR-0777
·
20: den
v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku
·
př.
20.HH-0777
·
20: den
v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku
Referenční,
varovné nebo kritické hodnoty
Zdroj: dle příbalového letáku
Sérum, plazma:
0-150 let muži: 0,17-0,85 µkat/
0-150 let ženy: 0,17-0,6µkat/l
Interpretace výsledků, konzultační činnosti a
hlášení
Zvýšené hodnoty aktivity AST v séru, plazmě se
nachází u:
- akutní virové hepatitidy (AST zvýšena 20 –
50x, normalizace stavu za 6 - 8 týdnů)
- chronické hepatitidy (1,5 - 4násobné zvýšení
přetrvávající 6 měsíců)
- akutního toxického poškození jater (na
alkohol je AST citlivější než ALT)
- jaterní nekrózy
- akutní pankreatitidy
- hemolytického onemocnění
- gangrény
- pulmonární embolie
- progresivní svalové dystrofie
- extrahepatální cholestázy
- infekční mononukleózy
- akutního infarktu myokardu (počátek vzestup
4-8 hodin, maximum za 16-48 hodin)
- operace srdce
- dlouhotrvající těžké tělesné námahy
- sepse
- dekompenzované jaterní cirhózy (max. 4-5
krát vyšší aktivita, většinou vyšší než ALT)
- karcinomu jater (5-10 násobné zvýšení, ALT
bývá vyšší než AST)
- metastáz do jater (pomalý vzestup)
- srdečního selhání - městnání krve
v játrech (zvýšení 10 až 40krát)
- požití alkoholu
- aplikace některých léků (penicilin,
salicyláty, opiáty)
Snížení aktivity AST v séru, plazmě
- provází deficit vitaminu B6
(pyridoxinu)
- u urémie
- po podání některých léků (metronidazolu,
trifluoperazinu)
Lze vypočítat poměr aktivit AST/ALT (tzv. de Ritisův kvocient), který
slouží jako prognostický ukazatel.
Hodnoty>
0,7 (1) signalizují závažnější poškození (nekrosu hepatocytu, uvolněním
mitochondriální AST). Nejvyšší hodnoty se nachází u alkoholického poškození
jater ale i u infarktu myokardu a svalové dystrofie.
Postup
pro nahlášení kritické hodnoty výsledku laboratorního vyšetření je uveden ve
směrnici S-OKBH-012 Směrnice pro vydávání výsledků.
Řízení kvality
Ke
kontrole a řízení kvality pro stanovení
AST v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy
Biorad Liquid Assayed Multiqual se sérovou matricí ve třech rozmezích
koncentrace pro AST měřené na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas
6000/c501.
Příprava:
Tekutá
kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě
Před
použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla
pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro
zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny.
Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány
v lednici při +2 až +
Stabilita:
Tekutá
kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě
Použití:
Měření
kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci,
po doplnění reagencie. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem.
Postupuje se podle směrnice S‑OKBH-004
Směrnice pro IKK
Dokumentace:
Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány
v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny
do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž
validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány
v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové
měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku.
Součástí kontroly a řízení kvality je
pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality organizovaných v
rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí účastní nejméně 2x
ročně.
Poznámky
nevyplněno
Jiné související informace
nevyplněno
Literatura
Young, D.S.: Effects of drugs on clinical
laboratory tests. AACC, 5th ed. AACC Press, 2000.
Racek, J. et al: Klinická biochemie. Galén,
Praha, 2006, ISBN 80-7262-324-9.
Kolektiv autorů: Preanalytická fáze, Česká
společnost klinické biochemie ČLS JEP a SEKK, Pardubice, 2005, ISBN
80-239-5198-X.
Vnitřní materiály firmy ROCHE
Zima,
T.:Laboratorní diagnostika, Galén, Praha 2007
Kopáč,
J.:Lékařská laboratorní diagnostika, Polygraf, Turnov, 2004
Appendixy
nevyplněno
Autorské poznámky
nevyplněno
Recenze, schválení
Autor: Mgr. Pavlína Babičová