OSN-SAbstraktOSN-E

Stanovení katalytické aktivity enzymu AST v séru a v plazmě enzymaticky soupravou Roche Cobas ASTLP (IFCC) na analyzátoru Cobas 6000, modul c501.

 

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentů a textůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

S-OKBH-005 Směrnice EHK

S-OKBH-019 Verifikace postupů měření

PI-OKBH-04 Práce s LIPOCLEAR

PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000

Příbalový leták Roche Cobas ASTLP pro kvantitativní stanovení AST, kat.č. REF04467493190

Příbalový leták pro Systémový kalibrátor Roche C.f.a.s., katalogové číslo 10759350190

Příbalový leták konkrétního používaného tekutého kontrolního materiálu společnosti Biorad,LiquichekTM

 

 

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

sérum/plazma

AST, Aspartátaminotransferáza, dříve GOT

Reagenční souprava: Roche Cobas ASTLP kat.č. REF04467493190

Název v lokálním číselníku LIS: AST

Klíč v lokálním číselníku LIS: AST

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 24

Kód metody v analyzátoru: 686

Název metody v analyzátoru: AST

Seznam zdravotních výkonů VZP: 81357 AST

81113 AST STATIM

 

OSN-SPrincipOSN-E

IFCC metoda.

AST katalyzuje transaminační reakci L-aspartátu a 2-oxoglutarátu, kdy se tvoří L-glutamát a oxalacetát:

 

                                                     AST ze vzorku                    

L-aspartát + 2-oxoglutarát          L-glutamát + oxalacetát

 

Přídavkem pyridoxal fosfátu k reakční směsi se zajistí maximální katalytická aktivita AST.

Oxalacetát je za katalýzy malátdehydrogenázy (MD) redukovaný na malát a současně se oxiduje redukovaného nikotinamidadenindinukleotid (NADH) na NAD+:

 

                                                                MD

oxalacetát + NADH                                       malát + NAD+

 

Pokles absorbance NADH se sleduje fotometricky (kineticky) při 340/410 nm a je úměrný aktivitě enzymu AST ve vzorku.

Endogenní pyruvát je odstraněn během inkubační periody účinkem LDH

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH, úsek biochemický, Nemocnice AGEL Ostrava - Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15, 703 84 Ostrava-Vítkovice

 

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

 

OSN-SFáze před vyšetřenímOSN-E

Stanovení aktivity AST v séru patří mezi základní rutinní metody klinické biochemie a má celou řadu indikací. Indikací pro vyšetření je především posouzení onemocnění jater. Pro diagnostiku infarktu myokardu má již stanovení aktivity AST jen omezený význam vzhledem k malé specificitě.

 

Výsledek stanovení AST ovlivňuje fyzická aktivita (zvyšuje o 2-6 %, ale velmi těžká tělesná námaha až o 75%), věk (2-3x vyšší aktivita u dětí než u dospělých), pohlaví (muži mají vyšší aktivitu než ženy), těhotenství (mírně snižuje), požití alkoholu (zvyšuje), poloha při odběru (vleže je aktivita o 10-15% nižší), denní rytmus (nejvyšší hodnoty bývají mezi

7-11 hodinou, změny během dne až o 15-20%) a aplikace některých léků (penicilin, salicyláty, opiáty).

 

AST se nalézá v myokardu a v kosterním svalu a dále v mozku, játrech, ledvinách, pankreatu, slezině, plicích, erytrocytech a leukocytech. Nejvyšší aktivita je v játrech a kosterních svalech. Jsou známé dvě formy AST: cytoplazmatický izoenzym (412 aminokyselin, Mr = 46116) a mitochondriální izoenzym

(430 aminokyselin, Mr = 47475). Ke zvýšení aktivity AST v krvi dochází při zvýšení permeability buněčné membrány, kdy se vyplavuje cytoplazmatický izoenzym. Při těžším poškození buněk se do krve vyplavuje i mitochondriální izoenzym.

AST patří mezi transferázy přenášející dusíkaté skupiny, konkrétně aminoskupinu. Katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Tato reverzibilní reakce se uplatňuje při syntéze i odbourávání aminokyselin.

Koenzymem je pyridoxalfosfát-derivát vitaminu B6 (pyridoxin). V séru není tento koenzym přítomen vždy v dostatečném množství, proto se přidává k reakční směsi, čímž může dojít k vzestupu naměřených hodnot až o 20 %. 

 

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Sérum: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky

s aktivátorem srážení nebo se separačním gelem za použití uzavřeného odběrového systému. Speciální příprava pacienta ani dieta není nutná, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno.

Plazma: Li-heparin, EDTA

Při odběru primárního vzorku se postupuje podle pracovní instrukce PI-OKBH-19 Odběr vzorku.

 

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán ve směrnici S-OKBH-006 Směrnice pro transport a příjem vzorků.

Skladování

Sérum/plazma je na OKBH po provedení analýzy skladováno v lednici při +2 až + 8°C po dobu 2 dnů pro potřeby dodatečně požadovaných vyšetření. Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedenému v  LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

V případě delšího skladování pro potřebu analýzy, je sérum/plazma skladováno zamraženo při teplotě -20°C po dobu maximálně 1 měsíce.

Interference sérum/plazma

Stanovení ovlivňuje hemolýza je-li koncentrace hemoglobinu > 12,4 µmol/l

Stanovení ovlivňuje koncentrace konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu, je- li >1026 µmol/l

Stanovení ovlivňuje lipémie je-li index L > 150

 

Stabilita měřené veličiny v séru a plazmě dle příbalového letáku

+20 až +25°C: 4 dny, +2 až +8°C: 7 dnů,3 měsíce při -20 0C

 

OmezeníOSN-E

Laboratoř může odmítnout přijetí materiálu a neprovést požadované vyšetření z obecných důvodů uvedených v Laboratorní příručce v kapitole kritéria pro přijetí nebo odmítnutí primárních vzorků.

 

 

OSN-SManipulace se vzorkyOSN-E

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 10 minut při rychlosti 2000 g (rcf) resp. 3333 ot/min. Po centrifugaci je odeslána k analýze. Vzorky obsahující sraženinu musí být před analýzou opět centrifugovány. 

 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga

Analyzátor ROCHE Cobas 6000, modul c501

 

OSN-SReagencieOSN-E

Souprava pro biochemický analyzátor Cobas c 501 ASTLP - 425 testů

Diluent NaCl 9%

Výrobce soupravy: Roche diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim

Dodavatel soupravy: Roche s.r.o., Diagnostics division, Na Valentince 336/4, 150 00 Praha - 5

 

reagencie

obsah reagencie

R1

TRIS pufr: 264 mmol/l pH 7,8 (při +37 °C)

L-aspartát: 792 mmol/l

Albumin (hovězí): 0,25%

LDH (mikroorganismy): ³ 48mkat/l

MDH (mikroorganismy): ³ 24mkat/l

konzervans

R2

Pyridoxalfosfát: 730 mmol/l

konzervans

R3

2-oxoglutarát: 94 mmol/l

NADH (kvasinky): ³ 1,7 mmol/l

konzervans

 

Skladování: Reagencie jsou skladovány v lednici při teplotě +2 až + 8 °C

Stabilita: Neotevřené reagencie jsou stabilní do označené doby exspirace při +2 až + 8 °C.

Stabilita v analyzátoru: 12 týdnů, Diluent NaCl 9% 12 týdnů

Manipulace s reagenciemi: reagencie jsou připraveny k použití do analyzátoru bez úprav.

Ověřování kvality: Provádí se denně pomocí interní kontroly kvality.

 

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Odběrové nádobky

Špičky k automatickým pipetám

 

OSN-SPříprava k činnostiOSN-E

Přístroj se uvede do stavu Stand By dle návodu v manuálu analyzátoru, PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

Silně chylózní vzorky běžně nezpracováváme. Jestliže lékař stanovení AST požaduje, postupujeme podle návodu pro práci s LIPOCLEAR  PI-OKBH-04 Práce s LIPOCLEAR.

 

OSN-SPracovní postupOSN-E

Množství pipetovaného vzorku séra, plazmy: 9,0 µl

 

Přesný popis analýzy včetně ovládání přístroje, je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

Záznamy o pravidelné údržbě analyzátoru jsou uvedeny v provozním deníku.

 

Denně, před vlastním měřením vzorků, se provede kontrola kvality v kontrolních sérových materiálech na dvou hladinách   S-OKBH-004 Směrnice pro IKK

 

V případě, že výsledky kontrolních materiálů neodpovídají nastavenému tolerančnímu rozmezí, musí se nalézt a odstranit závada, eventuálně provést nová kalibrace a následně zopakovat kontrola kvality.

Vyhovuje-li naměřený výsledek očekávané hodnotě kontrolního materiálu, je možné přistoupit k vkládání vzorků do přístroje. Vzorky označené čárovým kódem jsou kontrolovány na přítomnost hemolýzy, chylozity a jsou vkládány do šedých stojánků. Pokud je biologického materiálu málo přepipetuje se do Hitachi kepu, který se umístí do jiné plastové zkumavky označené čárovým kódem.

Pokud je analyzátor ve stavu STAND BY, stiskneme ikonu START v základní obrazovce řídícího počítače pro zahájení analýzy, která dále probíhá automaticky.

Požadavky na analýzy se do analyzátoru přenášejí počítačovou sítí prostřednictvím laboratorního informačního systému (LIS) nebo se mohou zadávat ručně pomocí klávesnice řídícího počítače analyzátoru.

Výsledky se z analyzátoru automaticky přenáší zpět do LIS ke kontrole a schválení, které provádí pověřený pracovník.

Obsluha analyzátoru se řídí vnitřními bezpečnostními a hygienickými předpisy laboratoře a pracovní instrukcí   PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

1. Vloží se reagenční souprava.

2. V případě potřeby se provede kalibrace.

3. Vloží se analyzované vzorky do šedého stojánku, který se umístí na posuvný pás

4. Pokud je analyzátor ve stavu STANDBY, stiskne se ikona START a tím se zahájí analýza, která dále probíhá automaticky.

5. Výsledky testů jsou průběžně z přístroje odesílány do systému LIS, kde jsou kontrolovány.

 

OSN-SKalibrace a návaznostOSN-E

Přesný popis kalibrace metody je uveden v manuálu analyzátoru PI-OKBH-18 Manuál analyzátoru Cobas c501/6000.

 

Ke kalibraci metody pro sérum (plazmu) se používá kalibrátor C.f.a.s., kat.č. 10759350190, který je připraven z lidských sér s chemickými aditivy a příslušnými enzymy lidského, zvířecího a rostlinného původu s deklarovanou hodnotou pro AST.

 

Návaznost kalibrátoru:

Metoda je standardizována podle originální formulace IFCC použitím kalibrovaných pipet spolu s manuálním fotometrem. Stanovením absolutních hodnot a specifické absorptivity substrátu.

 

Příprava kalibrátoru:

Kalibrátor je dodáván v lyofilizovaném stavu.

 

Doporučený postup rekonstituování lyofilizovaného kalibrátoru:

1.Opatrně otevřít lahvičku a vyjmout gumovou vložku. Přitom věnovat maximální pozornost zabránění   ztrátám lyofilizovaného materiálu zachyceného na gumové vložce.

2.Přidat do lahvičky přesně 3,0 ml vody Aqua pro injectione Braun.

3.Uzavřít gumovou vložkou a po 30 minutách opatrně promíchat (netřepat!) až do kompletního rozpuštění obsahu.

 

Stabilita: Lyofilizovaný kalibrátor je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu při skladování v lednici +2 až + 8°C. Otevřený a rekonstituovaný materiál je stabilní 2 dny uložený v lednici při +2 až + 8 °C. Alikvoty kalibrátoru se uchovávají v mrazáku při teplotě -20 °C po dobu max.30dní.

 

Vlastní kalibrace:

Kalibrace je 2-bodová, lineární RATE a provádí se pomocí sérové matrice v odpovídajícím černém kalibračním stojánku, nulový bod je deionizovaná voda tzv. reagenční blank.

Bezprostředně po provedení kalibrace se musí provést kontrola kvality.

Frekvence kalibrace:

Provádí se při změně šarže reagencie a dále podle potřeby v souvislosti s vyhodnocováním kontroly kvality a stability kalibrace reagencie v přístroji.

 

Způsob dokumentace kalibračních dat: Provedené kalibrace se uchovávají v paměti analyzátoru. Výsledky každé kalibrace jsou vytištěny a založeny do dokumentace kalibrací Roche cobas c501

 

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristika spolehlivosti z příbalového letáku.

 

Rozsah měření v séru, plazmě:

Při stanovení AST v séru, plazmě je oblast linearity 0,08 – 11,7 µkat/l

 

Opakovatelnost (přesnost v sérii):

Sérum, plazma:  

Opakovatelnost (n=21)

Průměr [mkat/l]

SD [mkat/l]

CV [%]

Precinorm U

0,802

0,01

1,3

Precipath U

2,46

0,02

0,6

Lidské sérum 1

2,52

0,02

0,7

Lidské sérum 2

0,284

0,017

6,0

               

Mezilehlá preciznost (mezi sériemi):

 

Mezilehlá preciznost

Průměr [mkat/l]

SD [mkat/l ]

CV [%]

Precinorm U

0,818

0,013

1,6

Precipath U

2,49

0,02

0,8

Lidské sérum 3

0,680

0,022

3,1

Lidské sérum 4

3,17

0,05

1,3

 

Mez detekce                        0,08 µkat/l

Mez stanovitelnosti:           výrobce neuvádí, odvozena z meze detekce 0,24 µkat/l

 

Korelace s jinou metodou: Hodnoty AST získané na analyzátoru Roche/cobas c501 byly porovnány s hodnotami stanovenými použitím odpovídající reagencie na analyzátoru Roche/Hitachi 917

 

Typ vzorku

Počet vzorků

Rovnice

Passing/Bablok

Korelační koeficient

Rozmezí vzorku

sérum

177

Y=1,00x- 0,0409

0,960

0,752 – 11,3 µkat/l

 

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu AST v séru, plazmě pro analyzátor Roche cobas c 501.

 

Dokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Hodnoty výsledků stanovení AST v séru, plazmě se udávají na dvě desetinná místa v μkat/l.

Poznámka: Přepočet jednotek používaných pro AST: U/l x 0,0167 = μkat/l.

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, další pracovní den jsou ráno před začátkem provozu archivovány na externí disk. Všechny výsledky se také archivují v elektronické formě v laboratorním informačním systému a denně je zálohována hlavní kniha.

 

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě u příjmového okna v laboratoři.

 

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

 

 

Výsledkový list obsahuje:

·         identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

·         odkaz na akreditaci laboratoře

·         datum a čas vydání nálezu

·         jednoznačnou identifikaci pacienta

·         zdravotní pojišťovnu pacienta

·         identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

·         identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

·         diagnózu pacienta

·         druh biologického materiálu (např. sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

·         jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

·         datum a čas přijetí vzorku laboratoří

·         datum a čas odběru vzorku,

·         výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

·         označení akreditované metody

·         referenční meze

·         interpretaci výsledků, je-li to nutné

·         jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

·         identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

·         zkratky identifikující žádanku

př. 20.BR-0777

·         20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

·         př. 20.HH-0777

·         20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

 

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-

Zdroj: dle příbalového letáku

Sérum, plazma:

                                0-150 let muži:   0,17-0,85 µkat/

                                0-150 let ženy:   0,17-0,6µkat/l

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Zvýšené hodnoty aktivity AST v séru, plazmě se nachází u:

-       akutní virové hepatitidy (AST zvýšena 20 – 50x, normalizace stavu za 6 - 8 týdnů)

-       chronické hepatitidy (1,5 - 4násobné zvýšení přetrvávající 6 měsíců)

-       akutního toxického poškození jater (na alkohol je AST citlivější než ALT)

-       jaterní nekrózy

-       akutní pankreatitidy

-       hemolytického onemocnění

-       gangrény

-       pulmonární embolie

-       progresivní svalové dystrofie

-       extrahepatální cholestázy

-       infekční mononukleózy

-       akutního infarktu myokardu (počátek vzestup 4-8 hodin, maximum za 16-48 hodin)

-       operace srdce

-       dlouhotrvající těžké tělesné námahy

-       sepse

-       dekompenzované jaterní cirhózy (max. 4-5 krát vyšší aktivita, většinou vyšší než ALT)

-       karcinomu jater (5-10 násobné zvýšení, ALT bývá vyšší než AST)

-       metastáz do jater (pomalý vzestup)

-       srdečního selhání - městnání krve v játrech (zvýšení 10 až 40krát)

-       požití alkoholu

-       aplikace některých léků (penicilin, salicyláty, opiáty)

 

Snížení aktivity AST v séru, plazmě

-       provází deficit vitaminu B6 (pyridoxinu)

-       u urémie

-       po podání některých léků (metronidazolu, trifluoperazinu)

 

Lze vypočítat poměr aktivit AST/ALT (tzv. de Ritisův kvocient), který slouží jako prognostický ukazatel.

Hodnoty> 0,7 (1) signalizují závažnější poškození (nekrosu hepatocytu, uvolněním mitochondriální AST). Nejvyšší hodnoty se nachází u alkoholického poškození jater ale i u infarktu myokardu a svalové dystrofie.

 

Postup pro nahlášení kritické hodnoty výsledku laboratorního vyšetření je uveden ve směrnici S-OKBH-012 Směrnice pro vydávání výsledků.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

 

Ke kontrole a řízení kvality pro stanovení  AST v séru, plazmě se používá tekutý kontrolní materiál firmy Biorad Liquid Assayed Multiqual se sérovou  matricí ve třech rozmezích koncentrace pro AST měřené na biochemickém analyzátoru ROCHE Cobas 6000/c501.

 

Příprava:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C.

Před použitím se nechá kontrola za laboratorní teploty a bez přístupu přímého světla pozvolna rozpustit za občasného promíchání kroužením lahvičky pro zajištění homogenity materiálu. Netřepe se, aby se zabránilo tvorby pěny. Z rozmraženého materiálu se připraví alikvoty, které jsou uchovány v lednici při +2 až +8 °C. Před použitím se opatrně alikvot promíchá pro zajištění homogenity vzorku kontroly.

 

Stabilita:

Tekutá kontrolní séra se uchovávají zamražená při teplotě -20°C, v tom případě jsou stabilní až do doby exspirace vyznačené na obale. Připravené alikvoty kontroly se uchovává v v lednici při +2 až +8 °C do spotřebování, nejdéle 1 týden.

 

 

 

 

 

Použití:

Měření kontrolního materiálu se provádí denně na dvou hladinách, po každé kalibraci, po doplnění reagencie. Výsledky jsou kontrolovány pověřeným pracovníkem. Postupuje se podle směrnice S‑OKBH-004 Směrnice pro IKK

 

Dokumentace:

Výsledky interní kontroly kvality jsou uchovávány v softwaru přístroje, zálohovány na externí disk a elektronicky přenášeny do programu LIS a Unity Real Time. Kontrola kvality je v LIS rovněž validována vedoucím úseku. Dlouhodobě jsou výsledky kontrol sledovány v programu UnityRealTime firmy Biorad a 1x měsíčně provedeno celkové měsíční zhodnocení výsledků kontrol vedoucím úseku. 

 

Součástí kontroly a řízení kvality je pravidelná účast na mezilaboratorních kontrolách kvality organizovaných v rámci České republiky společností SEKK. Laboratoř se jí účastní nejméně 2x ročně.

 

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

 nevyplněno

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

Young, D.S.: Effects of drugs on clinical laboratory tests. AACC, 5th ed. AACC Press, 2000.

Racek, J. et al: Klinická biochemie. Galén, Praha, 2006, ISBN 80-7262-324-9.

Kolektiv autorů: Preanalytická fáze, Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP a SEKK, Pardubice, 2005, ISBN 80-239-5198-X.

Vnitřní materiály firmy ROCHE

Zima, T.:Laboratorní diagnostika, Galén, Praha 2007

Kopáč, J.:Lékařská laboratorní diagnostika, Polygraf, Turnov, 2004

 

OSN-SAppendixyOSN-E

nevyplněno

 

OSN-SAutorské poznámky

nevyplněno

OSN-E

OSN-SRecenze, schváleníOSN-E

Autor: Mgr. Pavlína Babičová