OSN-SAbstraktOSN-E

Innovance D-Dimer je latexově zesílený imunoturbidimetrický test pro kvantitativní stanovení příčně zesítěných štěpných produktů fibrinu v lidské plasmě.

OSN-SSeznam souvisejících dokumentůOSN-E

Laboratorní příručka

Příručka kvality

Provozní řád

Skartační řád

S-OKBH-004 Směrnice pro IKK-OKBH

S-OKBH-005 Směrnice EHK

SOPT-Sysmex CS 2500

LP C-11 Informace k transportu vzorků

PI-OKBH-88 Manuál pro analyzátor Sysmex CS 2500

PI-OKBH-32 Provedení kontrol koagulace

PI-OKBH-59 Provedení kalibrace-koagulace

Uživatelský manuál Sysmex

OSN-SKódy, názvy, definice a terminologieOSN-E

D dimery

Reagenční souprava: Innovance D-Dimer, kat.č. OPBP03

Název v lokálním číselníků LIS: D-dimery

Klíč v lokálním číselníků LIS: PD-D

Číslo metody v lokálním číselníku LIS: 857

Kód metody v analyzátoru Sysmex CS 2500: 61

Seznam zdravotních výkonů VZP: 96847

Definice a terminologie

Rutinní metoda

D-Dimery=degradační produkt zesíťovaného fibrinu

FEU=fibrinogen equivalent unit

LIS=laboratorní informační systém

OSN-SPrincip a metoda postupuOSN-E

Polystyrolové částice, na které je navázána monoklonální protilátka (8D3) proti příčně zesítěné oblasti příčně zesítěných štěpných produktů fibrinu (D-dimer), aglutinují, pokud jsou v kontaktu se vzorkem, obsahujícím D-dimer. Oblast příčného zesítění je zrcadlově symerická, tj. epitop pro monoklonální protilátku je přítomen dvakrát. Proto stačí jedna protilátka k vyvolání aglutinační reakce, která je detekována nárůstem turbidity.

OSN-EPaprsek monochromatického světla se střetne se suspenzí mikrolatexových částic pokrytých specifickou protilátkou. Jestliže je vlnová délka světla větší než průměr latexových částic (není přítomen antigen D‑dimerů), dochází pouze ke slabé absorbci. V přítomnosti antigenu dochází k aglutinaci latexových částic a vzniku agregátů větších než vlnová délka procházejícího světla (500–600 nm, optimum 540 nm). Zvýší se absorpce světla, a změna absorpce je úměrná hladině antigenu ve vzorku.

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

OKBH. úsek koagulací, Nemocnice AGEL Ostrava-Vítkovice a.s., Zalužanského 1192/15,70384 Ostrava-Vítkovice

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle ČSN 01 8003, směrnice VN BOZP č.8.02, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem. Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím, pokud možno vlažné vody, popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Po umytí ošetřit vhodným reparačním krémem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

OSN-SFáze před vyšetřenímOSN-E

D Dimer je konečným produktem lýzy zesiťovaného fibrinu plazminem. Fibrin je polymer vznikající z fibrinogenu štěpením trombinem (faktor IIa). Fibrinogen je štěpen tak, že jsou odděleny dva peptidy, nazývané fibrinopeptid A (FBA, 16 aminokyselin) a fibrinopeptid B (FPB, 14 aminokyselin). Jejich odštěpením se odhalí vazebná místa v centrální části molekuly a vzniká fibrinový monomer schopný spontánní polymerace na rozpustný fibrin. Centrální část molekuly se označuje také jako E doména, postranní části jako D domény. Spontánní polymerace fibrinových monomerů zpočátku probíhá jako interakce mezi E a D doménami různých molekul. Vznikají vláknité protofibrily, které se dále spojují opět interaktivním způsobem příčně mezi sebou v tzv. E-D kontaktním místě a objem fibrinu tak narůstá. Definitivní zpevnění vytvoří trombinem aktivovaný faktor XIII, který vytvoří kovalentní vazby mezi D doménami za uvolnění molekuly amoniaku. Interaktivní vazby ve fibrinovém vlákně mohou být štěpeny plazminem, kovalentní vazba mezi D doménami je k tomuto štěpení odolná a dimery vytvořené ze dvou D domén jsou tedy nejmenším zbytkem fibrinolýzy, který je pak z oběhu vyloučen prostřednictvím retikuloendoteliálního systému.

Význam stanovení D-dimerů spočívá především v diagnose tromboembolických stavů. Zvýšené koncentrace D-dimerů ukazují na přítomnost koagula a byly popsány u hluboké žilní trombózy v končetinách, plicní embolie a diseminované intravaskulární koagulace DIC. Pokud jsou výsledky stanovení D-dimerů nalezeny pod hodnotou cut-off je možno tromboembolické stavy pomocí negativní prediktivní hodnoty specifické pro daný test (NPV) vyloučit.

OSN-SOdběr primárního vzorku a transportOSN-E

Odběr

Plazma: Odběr se provádí standardním způsobem ze žilní krve, do plastové zkumavky s 3,2%

citrátem sodným, je nutné dodržet přesný poměr protisrážlivého činidla a krve (1:9) –

tolerance 10%, pro obvyklé vyšetřování je vhodný odběr ráno po 12 hod. lačnění.

Transport

Transport materiálu na oddělení OKBH VTN je popsán v laboratorní příručce LP C-11 Informace k transportu vzorků. Transport materiálu musí být šetrný, rychlý, při teplotě +15°C až+25 °C. Doba transport by neměla být delší než 2 hod.

Skladování

Plazma se po provedení analýzy skladuje při laboratorní teplotě. Plazma nesmí být skladována v lednici! Doba dodatečně požadovaných vyšetření se řídí podle seznamu uvedeném v LP C-03 Ústní požadavky na vyšetření.

Interference

Stanovení může ovlivnit hemolýza a lipémie.

Stabilita analytu v primárním vzorku a v plazmě

+15°C až+ 25°C: 4 hodiny

OSN-SManipulace se vzorky

Manipulace se vzorky probíhá podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem uvedených v Laboratorní příručce a Příručce kvality.

Primární zkumavka s biologickým materiálem je centrifugována 15 minut při rychlosti 2500 g. Pro vitální indikace ultracentrifugace 2 min. při 8000 ot./min. Po centrifugaci se ihned provede stanovení. Vzorky obsahující sraženinu, vzorky, u kterých nebyl dodržen poměr krve a činidla a silně chylózní a hemolytické se nezpracovávají.

OSN-SOmezeníOSN-E

- chylózní plazma může vést k falešně nízkým hodnotám

- přítomnost revmatoidního faktoru (> 50 IU/ml) může vést k falešně vyšším hodnotám

- vzácně se mohou vyskytnout protilátky proti hovězímu albuminu nebo proti myším protilátkám a toto může vést opět k falešně vyšším hodnotám

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Centrifuga Eppendorf 5702, centrifuga Hettich EBA 200S, automatické analyzátory

Sysmex CS 2500-A (výrobní číslo 23894) a Sysmex CS 2500-B (výrobní číslo 25146)

OSN-SReagencieOSN-E

Výrobce/dodavatel: Siemens s.r.o., Evropská 873,664 42 ModřiceOSN-E

Innovance D-Dimer
3x pro 4 ml Innovance D-Dimer Reagent

3x5 ml Innovance D-Dimer Buffer
3x2,6 ml Innovance D-Dimer Supplement

3x5 ml Innovance D-Dimer Diluent

2x pro 1 ml Innovance D-Dimer Calibrator

Innovance D-Dimer
6x pro 4 ml Innovance D-Dimer Reagent

6x5 ml Innovance D-Dimer Buffer
6x2,6 ml Innovance D-Dimer Supplement

6x5 ml Innovance D-Dimer Diluent

2x pro 1 ml Innovance D-Dimer Calibrator

Složení

Innovance* D-DIMER REAGENT, lyofilizovaná; obsahuje polystyrénové částečky potažené monoklonálními myšími protilátkami (protilátky vytvořené na základě dohody s INNOGENETICS N.V.) v pufrované matrici obsahující lidský sérový albumin.

Konzervační látky: amphotericin B (0,625 mg/l), gentamicin (6,25 mg/l)

Innovance* D-DIMER BUFFER, kapalný; pufrovaný fyziologický roztok s detergentem a polymerními karbohydráty.

Konzervační látka: azid sodný (<1 g/l)

Innovance*D-DIMER SUPPLEMENT, kapalný; pufrovaný fyziologický roztok s proteiny (Heterofilní blokující reagencie; HBR)

Konzervační látka: azid sodný (<1 g/l)

Innovance* D-DIMER DILUENT, kapalný; pufrovaný fyziologický roztok s detergentem

Konzervační látka: azid sodný (<1 g/l)

Innovance* D-DIMER KALIBRÁTOR, vyroben na bázi lyofilizované lidské plasmy obsahující přípravek D‑dimerů

Konzervační látky: 5-chloro-2-methyl-4-isothiazol-3-on a -methyl-4-isothiazol-3-on (<1,0 mg/l) azid sodný (<1 g/l)

Příprava reagencie

Součásti kitu jsou specifické pro danou šarži. Jiná kombinace komponent, než je uvedeno na vnějším obalu kitu by mohla vést k chybným výsledkům.

Innovance D-DIMER REAGENT se rozpustí přesně ve 4 ml injekční vody. Lahvička se třikrát překlopí a nechá se stát při laboratorní teplotě (+15°C až +25^oC) po dobu min. 30 min. Poté se lahvička s reagencií opět třikrát překlopí a vloží do reagenční pozice koagulačního automatu.

Innovance D-DIMER SUPLEMENT, BUFFER, DILUENT jsou kapalné reagencie, připravené k použití.

Stabilita a podmínky skladování

Neotevřený testkit je nutno skladovat při +2°C až +8^oC a je stabilní až do data uvedeného na etiketě.

Stabilita po rekonstituci, resp. prvním otevření (uzavřená lahvička):

Teplota	Innovance* D-DIMER REAGENT	Innovance* D-DIMER BUFFER	Innovance* D-DIMER SUPPLEMENT	Innovance* D-DIMER DILUENT	Innovance* D-DIMER CALIBRATOR
+2°C až +8 °C	4 týdny	4 týdny	4 týdny	4 týdny	-
≤ -18 °C**	4 týdny	4 týdny	4 týdny	4 týdny	-
+15°C až +25 °C	-	-	-	-	4 hodiny
Otevřená lahvička v přístroji	52h	52h	52h	52h

* chránit před zdrojem tepla, např. před přímým slunečním světlem
** opakované zamražení není možné. Rozmražená reagencie nemůže již být skladována při +2°C až +8^oC. Údaje o stabilitě reagencií v přístroji jsou uvedeny v aplikačních listech pro jednotlivé přístroje.

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Kyvety do koagulometru, promývací roztoky, destilovaná voda.

OSN-SPracovní postupOSN-E

Reagencie Innovance D-Dimer Reagent, Supplement a Buffer se umístí do koagulometru CS 2500 do reagenčního kruhu, Innovance D-Dimer Diluent do prostoru pro diluenty.

Provedeme identifikaci vzorku, vzorek vložíme do koagulometru do stojanu na vzorky a měření spustíme stisknutím klávesy “Start”. Viz. návod na obsluhu přístroje.

OSN-SKalibrace a návaznost

Kalibrace se provádí dle pracovní instrukce PI-OKBH-59 Provedení kalibrace-koagulace.

Nastavení koagulometru a provedení kalibrace viz manuály přístrojů.

Kalibrace se provádí na kalibrační materiál Innovance D-Dimer Calibrator (součást soupravy) s atestovanou hodnotou cca 5,0 mg/l FEU

Ředění kalibrační křivky:

Jednotlivé body kalibrační křivky jsou nastaveny na následující poměry ředění kalibračního materiálu: 1/1, ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. Body 1/8,1/16,1/32 jsou při kalibraci měřeny v dubletu a pro kalibrační křivku je použit průměr z obou stanovení. Ředění se provádí pomocí reagencie Innovance D-Dimer Diluent.

Příprava kalibračního materiálu:

Innovance D-dimer Calibrator se rozpustí přesně v 1 ml injekční vody, promíchá se a nechá se stát při +15°C - +25^oC 30 min. Před použitím se opět opatrně promíchá.
Stabilita po rekonstituci: Při +15°C – +25^oC, 4 hod

Platí přepočet, že 1 mg/l = 2 FEU.

Rozsah měření je dán rozsahem kalibrační křivky.

OSN-SCharakteristika spolehlivostiOSN-E

Charakteristika spolehlivosti, specifické vlastnosti testu, srovnání metod viz aplikační listy Innovance D-dimer na CS 2500.

Vzorky s obsahem D-dimerů vyšším než 5,0 mg/l FEU je nutno ředit Innovance D-Dimer Diluentem.

Lipemické vzorky nebo vzorky, které obsahují částečky neodstranitelné centrifugací, je třeba z vyšetření vyloučit.

Vzorky od pacientů mohou obsahovat heterofilní protilátky (např. lidské protilátky proti myším (human anti-mouse antibodies, HAMA) nebo revmatoidní faktory, které by mouhou reagovat při imunoanalýze a mohou vést k falešně vyšším nebo nižším hodnotám.

Tento test byl koncipován tak, aby bylo možno minimalizovat vliv heterofilních protilátek. Nicméně nelze zaručit úplné vyloučení této interference.

Výsledky tohoto testu musí být vždy interpretovány s ohledem na diagnostickou historii pacienta, klinické příznaky a další nálezy.

Aktuální charakteristiky spolehlivosti:

Aktuální charakteristiky spolehlivosti jsou uvedeny v platném verifikačním protokolu.

OSN-SDokumentace, zpracování dat a vydávání výsledkůOSN-E

Koncentrace D-dimerů je udávána v mg/l FEU (v jednotkách fibrinogenového ekvivalentu) - vztažena k množství fibrinogenu používaného k přípravě standardu D-dimerů.

Pro hodnoty vyšší než 5,54 mg/l FEU provést následné stanovení s ředěním.

Rozsah měření při ředění do 35,2 mg/l FEU.

Výsledky stanovení jsou uloženy v softwaru analyzátoru, zálohují se na server VTN.

Výsledky vyšetření zanesené v LIS laboratoře se archivují v elektronické podobě.OSN-E

OSN-E Likvidace se řídí skartačním řádem.

Lékařům na odděleních a ambulancích Nemocnice Agel Ostrava-Vítkovice a.s. jsou výsledky vyšetření k dispozici elektronicky v NIS a v případě potřeby v tištěné podobě na příjmu OKBH.

Spolupracujícím lékařům jsou výsledky zasílány průběžně elektronicky a následující den doručovány v tištěné podobě se svozem biologického materiálu.

Výsledková zpráva obsahuje:

· identifikaci laboratoře, která výsledek vydala

· odkaz na akreditaci laboratoře

· datum a čas vydání nálezu

· jednoznačnou identifikaci pacienta

· zdravotní pojišťovnu pacienta

· identifikaci požadujícího subjektu (lokalizaci pacienta, je-li to vhodné)

· identifikaci požadujícího lékaře (resp. oddělení)

· diagnózu pacienta

· druh biologického materiálu (sérum, plazma, moč, krev u vyšetření krevního obrazu)

· jasně srozumitelnou identifikaci vyšetření

· datum a čas přijetí vzorku laboratoří

· datum a čas odběru vzorku

· výsledek vyšetření s odpovídajícími jednotkami (nejčastěji SI jednotky)

· označení akreditované metody

· referenční intervaly vyšetření

· interpretaci výsledků, je-li to nutné

· jiné poznámky (např. kvalita nebo dostatečnost primárního vzorku, pokud tato může nežádoucím způsobem ovlivnit výsledek požadovaného vyšetření)

· identifikaci osob, které výsledkovou zprávu kontrolovaly a schválily

· zkratky identifikující žádanku

· př. 20.BR-0777

· 20: den v měsíci, BR: biochemie rutina, 0777: číslo vzorku

· př. 20.HH-0777

· 20: den v měsíci, HH: hematologie, 0777: číslo vzorku

OSN-SReferenční, varovné nebo kritické hodnotyOSN-E

Hodnota cut-off: 0,50 mg/l FEU

Pro vyloučení plicní embolie u pacientů nad 50 let lze použít věkově závislé cut-off. Jeho základní hodnota je 0,500 mg/l FEU pro věkovou skupinu do 50 let a s každým dalším rokem věku se zvyšuje o 0,01 mg/l až do 80 let.

OSN-SInterpretace výsledků, konzultační činnosti a hlášeníOSN-E

Význam stanovení D-dimerů spočívá především v diagnose tromboembolických stavů. Zvýšené koncentrace D-dimerů ukazují na přítomnost koagula a byly popsány u hluboké žilní trombózy v končetinách, plicní embolie a diseminované intravaskulární koagulace DIC. Pokud jsou výsledky stanovení D-dimerů nalezeny pod hodnotou cut-off je možno tromboembolické stavy pomocí negativní prediktivní hodnoty specifické pro daný test (NPV) vyloučit.OSN-E

Hladiny v okolí hranice normy je potřeba posuzovat opatrně – možnost původu v drobných úrazech, fyzické námaze, i.m. injekce.

Hodnota D-dimerů bývá zvýšena po úrazech a operacích, běžně se zvyšuje v graviditě – jako odraz zvýšeného koagulačního obratu.

Platí přepočet, že 1 mg/l = 2 FEU.

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

Pro denní kontrolu přesnosti se používá atestované kontrolní plazma – normální a patologická hladina. Viz S-OKBH-004 Směrnice pro IKK-OKBH, PI-OKBH-32 Provedení kontrol koagulace

Variační koeficient analytického systému pro stejnou šarži kontrolní plazmy musí být menší než 15%.

Při výměně reagencie stejné šarže se provede kontrola pacientským vzorkem. Výsledky jsou kontrolovány laboratorním pracovníkem. Rozdíl výsledků měření nesmí přesáhnout nejistotu měření dané metody.

Externí kontrola kvality viz S-OKBH-005 Směrnice EHK

Kontrolní materiál

Innovance D-Dimer Controls

Balení obsahuje:

Innovance D-Dimer Control 1, 5x1 ml, koncentrace d-dimerů ca. 0,3 mg/l FEU

Innovance D-Dimer Control 2, 5x1 ml, koncentrace d-dimerů ca. 2,6 mg/l FEU

Výrobce: Siemens Healthcare Diagnostics

Příprava: Rozpuštění lahvičky s lyofilizátem přesně v 1 ml injekční vody, nechat stát 30 min při 15°C – 25^oC, před použitím opatrně promíchat.

Stabilita po rekonstituci:

Při 15°C – 25^oC 8 hod

Při 2°C – 8^oC 7 dnů
Při –20^oC 4 týdny

OSN-SPoznámky, zdroje variabilityOSN-E

· Zkoagulovanou plazmu netestujeme.

· U ikterických plazem je nutno mít na paměti jaterní poruchu a tím ovlivněné koagulační výsledky.

· Vliv ikterity a hemolýzy je uveden v oddíle „Charakteristika spolehlivosti“.

· Chylozní plazmy nelze testovat.

· Zdroje chyb při získávání plazmy:

§ nadměrná venostáza před odběrem krve

§ odebraná krev obsahuje tkáňový tromboplastin (způsobeno chybnou venepunkcí)

§ intenzivní třepání krve s citrátem

§ faktor V je inaktivován dlouhodobým skladováním plazmy při teplotě místnosti

§ chybná centrifugační technika

§ hemolýza

§ přítomnost stromat erytrocytů, které vyvolávají koagulaci

OSN-SLiteraturaOSN-E

SLP

Firemní příbalové letáky k soupravě, aplikační listy.

Doporučení ČHS ČLS JEP Referenční meze pro koagulační stanovení u dětí a dospělých, 2018

Doporučení ČHS ČLS JEP Preanalytika v hematologické laboratoři, 2021

Ricos C, Alvarez V, Cava F, Garcia-Lario JV, Hernandez A, Jimenez CV, Minchinela J, Perich C, Simon M. "Current databases on biologic variation: pros, cons and progress." Scand J Clin Lab Invest 1999;59:491-500.2014

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

nevyplněno

OSN-SRecenze, schválení

Autor: Mgr. Miková Eva